磷酸酶PHLPP對(duì)TLR及RIG-I觸發(fā)的Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的選擇性調(diào)控作用及機(jī)制研究.pdf

1、天然免疫應(yīng)答是由能夠識(shí)別病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecularpatterns，PAMPs)的受體所介導(dǎo)的，這些受體統(tǒng)稱(chēng)為模式識(shí)別受體(Pattern recognitionreceptor，PRRs)。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是一類(lèi)重要的模式識(shí)別受體，主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)表面，特異性識(shí)別病原體中特定的分子

2、結(jié)構(gòu)，激活其下游MyD88或TRIF依賴(lài)的信號(hào)通路，激活MAPK、NFκB或者IRF3信號(hào)，最終激活天然免疫細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子和Ⅰ型干擾素，構(gòu)成機(jī)體免疫系統(tǒng)抵御病原體入侵的第一道屏障。TLRs在各種生物體內(nèi)高度保守，目前在小鼠中己發(fā)現(xiàn)12種TLRs。
　　 另一類(lèi)受到廣泛關(guān)注的模式識(shí)別受體是維甲酸誘導(dǎo)的基因Ⅰ樣受體(retinoidacid-inducible geneⅠ(RIG-Ⅰ)-like receptors，RLRs)

3、，包括RIG-Ⅰ和MDA5(melanomadifferentiation-associated gene5)，它們都可以識(shí)別胞漿中的病毒RNA。常用于活化RIG-Ⅰ信號(hào)的RNA病毒有水泡口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)、仙臺(tái)病毒(Sendai virus，SeV)等。RIG-Ⅰ/MDA5識(shí)別相應(yīng)病毒RNA后，通過(guò)招募接頭分子IPS-1(Interferon-beta promoter stimu

4、lator1)等激活下游信號(hào)，引起IRF-3以及NF-κB的核轉(zhuǎn)位，最終促進(jìn)Ⅰ型干擾素和炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生，激發(fā)機(jī)體抗病毒反應(yīng)。
　　 TLR及RIG-Ⅰ不僅啟動(dòng)天然免疫應(yīng)答，控制炎癥反應(yīng)的性質(zhì)、強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間，還可以調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和類(lèi)型，成為連接初始免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答的橋梁。所以，TLR及RIG-Ⅰ信號(hào)過(guò)度活化或活化不足會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫功能異常和疾病的發(fā)生。許多其他信號(hào)通路參與對(duì)TLR及RIG-Ⅰ信號(hào)的嚴(yán)密調(diào)控，然

5、而到目前為止，對(duì)TLR和RIG-Ⅰ信號(hào)通路調(diào)控的分子機(jī)制還沒(méi)有完全研究清楚。因此，對(duì)TLR及RIG-Ⅰ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控機(jī)制的深入研究具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
　　 PHLPP(PH domain leucine-rich repeat protein phosphatase)是一種具有PH(pleckstrin homology)結(jié)構(gòu)域并且富含亮氨酸重復(fù)基序的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶，它由N端的PH結(jié)構(gòu)域、LRR(leucine-

6、rich repeat)結(jié)構(gòu)域、PP2C(protein phosphatase2C)樣磷酸酶活性結(jié)構(gòu)域以及C端的PDZ binding結(jié)構(gòu)域組成，大鼠的同源物編碼1687個(gè)氨基酸。以前的研究發(fā)現(xiàn)在大鼠腦組織細(xì)胞中，PHLPP能通過(guò)其LRR區(qū)域直接與K-Ras相結(jié)合，負(fù)向調(diào)控K-Ras和MAPK信號(hào)途徑；PHLPP也能夠抑制ERK通路活化，參與大鼠腦組織長(zhǎng)時(shí)間記憶的形成。PHLPP在多種腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)，能夠通過(guò)PP2C樣磷酸酶活性區(qū)特

7、異性作用于Akt的473位絲氨酸，使其去磷酸化，從而抑制Akt依賴(lài)的腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。PHLPP還可以依賴(lài)其PH區(qū)域使PKC去磷酸化，從而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)PKC的水平。這些研究提示PHLPP可通過(guò)其不同的功能域參與多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控。
　　 蛋白磷酸酶在免疫應(yīng)答中的調(diào)控作用受到越來(lái)越多的重視。已經(jīng)報(bào)道數(shù)個(gè)磷酸酶，包括SHP-1(Src homology region2 domain-containing phosph

8、atase1)、SHP-2、SHIP-1(Src homology2 domain containing inositol-5'-phosphatase-1)和MKP-1(MAPKphosphatase-1)等，分別通過(guò)不同的機(jī)制調(diào)控TLR或RIG-Ⅰ觸發(fā)的天然免疫應(yīng)答中炎性細(xì)胞因子和/或Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。那么PHLPP作為另一重要的參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控的蛋白磷酸酶，是否參與天然免疫應(yīng)答中TLR及RIG-Ⅰ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控尚不清楚。

9、>　　 本實(shí)驗(yàn)分三部分內(nèi)容對(duì)PHLPP是否參與天然免疫的調(diào)控以及可能的相關(guān)機(jī)制等問(wèn)題進(jìn)行了研究。
　　 一、PHLPP對(duì)TLR及RIG-Ⅰ觸發(fā)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生Ⅰ型干擾素的選擇性促進(jìn)作用
　　 我們研究發(fā)現(xiàn)PHLPP在小鼠腦組織、脾臟及淋巴結(jié)等組織和T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC、腹腔巨噬細(xì)胞以及RAW264.7細(xì)胞株等免疫細(xì)胞中廣泛表達(dá)。并且TLR配體LPS、poly(I∶C)刺激以及RIG-Ⅰ配體VSV感染可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)

10、胞表達(dá)PHLPP蛋白增加。
　　 結(jié)果顯示PHLPP促進(jìn)TLR配體誘導(dǎo)的TRIF依賴(lài)的以及RIG-Ⅰ配體誘導(dǎo)的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，而對(duì)其誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生以及MyD88依賴(lài)的細(xì)胞因子產(chǎn)生無(wú)明顯影響。
　　 二、PHLPP選擇性調(diào)控TLR及RIG-Ⅰ觸發(fā)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的分子機(jī)制研究
　　 為明確PHLPP各個(gè)結(jié)構(gòu)域的功能，我們根據(jù)PHLPP的分子結(jié)構(gòu)構(gòu)建了不同的PHLPP缺失突變載體。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染這些缺失突變載體后，

11、檢測(cè)對(duì)TRIF活化IFN-β報(bào)告基因的活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺失LRR或者PP2C結(jié)構(gòu)域的PHLPP突變體不能促進(jìn)TRIF活化IFN-β報(bào)告基因的活性，而缺失PH或者PDZ結(jié)構(gòu)域的PHLPP突變體仍然能夠顯著促進(jìn)TRIF活化IFN-β報(bào)告基因的活性；單一表達(dá)PP2C結(jié)構(gòu)域的PHLPP突變體不能促進(jìn)TRIF活化IFN-β報(bào)告基因的活性，而表達(dá)LRR和PP2C結(jié)構(gòu)域的PHLPP突變體能夠顯著促進(jìn)TRIF活化IFN-β報(bào)告基因的活性。同時(shí)，我們

12、發(fā)現(xiàn)在巨噬細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染缺失LRR或者PP2C結(jié)構(gòu)域的PHLPP突變體不能促進(jìn)poly(I：C)誘導(dǎo)的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。由此認(rèn)為，PHLPP正向調(diào)控TLR及RIG-Ⅰ觸發(fā)的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生是依賴(lài)于其LRR結(jié)構(gòu)域和磷酸酶活性結(jié)構(gòu)域PP2C。我們觀察了PHLPP對(duì)TLR及RIG-Ⅰ信號(hào)活化的MAPKs、NF-mκB的影響。
　　 結(jié)果表明巨噬細(xì)胞中PHLPP在細(xì)胞核內(nèi)通過(guò)其LRR結(jié)構(gòu)域與活化的IRF3 C端結(jié)合，通過(guò)其PP2C磷酸酶

13、活性區(qū)使IRF3 S332去磷酸化，從而抑制S332磷酸化依賴(lài)的IRF3泛素化和降解，維持IRF3蛋白的穩(wěn)定，促進(jìn)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。
　　 三、PHLPP通過(guò)促進(jìn)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生而參與抵抗病毒感染的作用
　　 為探討PHLPP正向調(diào)控TLR及RIG-Ⅰ觸發(fā)的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生這一功能在感染性疾病，特別是病毒感染性疾病中的作用，我們首先觀察了PHLPP對(duì)VSV復(fù)制的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PHLPP基因敲除小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞在VSV感染

14、后，培養(yǎng)上清中VSV病毒滴度(TCID50)顯著增加，用培養(yǎng)上清處理的HEK293細(xì)胞迅速出現(xiàn)細(xì)胞變圓等病毒感染性病變及細(xì)胞死亡；而在巨噬細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中中加入重組小鼠IFN-β，可以明顯降低VSV病毒滴度，減少HEK293細(xì)胞死亡率。上述結(jié)果表明PHLPP通過(guò)促進(jìn)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生而抑制了VSV的復(fù)制。
　　 進(jìn)一步我們?nèi)⌒∈篌w內(nèi)感染VSV24-48小時(shí)之后的臟器檢測(cè)病毒感染情況，發(fā)現(xiàn)PHLPP基因敲除小鼠的肝臟和脾臟組織中VSV

15、的復(fù)制和病毒滴度(TCID50)較對(duì)照小鼠顯著增加，表明PHLPP在體內(nèi)參與了抵抗VSV感染的效應(yīng)。
　　 本部分研究表明PHLPP通過(guò)促進(jìn)體內(nèi)TLR及RIG-Ⅰ觸發(fā)的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，抑制VSV的復(fù)制，提高小鼠對(duì)VSV體內(nèi)感染的抵抗能力，提示其在抵御病毒感染性疾病中發(fā)揮著重要的作用。
　　 綜合以上三部分研究結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)磷酸酶PHLPP參與了巨噬細(xì)胞中TLR及RIG-Ⅰ觸發(fā)的Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的正向調(diào)控；證明了PHLPP