蛋白酶激活受體-2在海水吸入大鼠急性肺損傷中的作用及機制研究.pdf

1、背景與目的： 海水淹溺可引起海水吸入型急性肺損傷(SW-ALI)，進一步發(fā)展可導致海水型急性呼吸窘迫綜合征(SW-ARDS)，病情兇險，死亡率高。由于炎癥反應是ALI發(fā)病的關鍵環(huán)節(jié)，人們將對ALI的研究轉向炎癥調控機制的研究，以期控制炎癥反應，減輕損傷，從而降低ALI的發(fā)病率和死亡率。蛋白酶激活受體-2(PAR2)屬G蛋白偶聯(lián)受體家族，激活后可參與炎癥反應，但在肺部炎癥反應中的致病作用還存在爭議，在SW-AIL中的作用尚未提及，

2、且PAR2激活后下游信號通路仍不清楚，有待進一步探討。FUT-175作為一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，可抑制PAR2的激活，減少炎癥介質和細胞因子的釋放，但其抗炎作用在ALI的研究中尚未提及，有待進一步研究。為此，本課題擬從細胞水平檢測海水對A549細胞PAR2表達的影響，從分子水平探討PAR2激活后的下游信號轉導通路以及FUT-175和PAR2抗體對其下游信號通路的干預作用，從器官水平觀察FUT-175對SW-ALI大鼠肺部炎癥反應和肺微血

3、管通透性的影響，旨在明確PAR2在SW-ALI中的作用及機制，從抗炎的角度揭示FUT-175對SW-ALI大鼠的保護作用，為臨床應用FUT-175治療SW-ALI提供更堅實的理論基礎和實驗依據(jù)。 方法： 1.將培養(yǎng)的A549細胞接種于6孔板中，隨機分為對照組(control)、海水干預2、4、8、16h組，各組細胞干預相應的時間后進行指標觀測。收集上清檢測TNF-α和IL-8濃度，收集細胞用實時熒光定量PCR法和West

4、ern blot法檢測PAR2 mRNA和蛋白表達水平。 2.將培養(yǎng)的A549細胞接種于6孔板中，隨機分為對照組(control組)、海水干預組(seawater組)、海水+PAR2抗體組(PAR2-antibody組)、海水+FUT-175組(FUT-175組)、海水+SB203580組(SB203580組)、海水+PD98059組(PD98059組)、海水+SP600125組(SP600125組)。對照組加入無血清培養(yǎng)液，海

5、水組加入海水培養(yǎng)8h；PAR2-antibody組用PAR2單克隆抗體2mg/L預處理1h后，加入海水繼續(xù)培養(yǎng)8h；FUT-175組用FUT-17510μM預處理1h后，加入海水繼續(xù)培養(yǎng)8h；SB203580組用SB20358010μM預處理1h后，加入海水繼續(xù)培養(yǎng)8h；PD98059組用PD9805910μM預處理1h后，加入海水繼續(xù)培養(yǎng)8h；SP600125組用SP6001250μM預處理1h后，加入海水繼續(xù)培養(yǎng)8h。control

6、組、seawater組、PAR2-antibody組和FUT-175組收集細胞用Western印跡法和EMSA法分別檢測磷酸化p38MAPK蛋白表達量、磷酸化ERK蛋白表達量、磷酸化JNK蛋白表達量和NF-κB活化水平；各組細胞收集上清檢測TNF-α和IL-8濃度。 3.采用海水吸入法復制大鼠ALI模型，吸入海水(4ml/kg)后成功建立ALl模型。將48只Wistar大鼠隨機分為對照組、海水吸入2、4、8h組，取肺組織用實時熒

7、光定量PCR法檢測PAR2 mRNA表達水平，用Western blot法和免疫組化法檢測PAR2蛋白表達情況。 4.采用海水吸入法和LPS吸入法復制大鼠ALI模型，96只Wistar大鼠隨機分為對照組(control)、海水組(seawater組)、LPS組(LPS組)和FUT-175治療海水吸入組(FUT-175組)。海水組和LPS組分別吸入海水(4ml/kg)和LPS(4mg/kg)建立ALl模型。seawater組：模型

8、復制成功后20min，經尾靜脈注射生理鹽水2ml/kg。FUT-175組：海水型ALI模型復制成功后20min，經尾靜脈注射FUT-17510mg/kg。4組大鼠觀察8小時，分別于模型建立及干預后0.5、1、2、4、8h進行動脈血氣分析，最后檢測肺微血管通透性(PMVP)、肺濕/干重比(W/D)、肺組織髓過氧化物酶(MPO)、血漿IL-8和TNF-α水平，并觀察病理學變化。 結果： 1.與正常對照組比較，海水處理后，A5

9、49細胞PAR2 mRNA在4h時顯著升高(P<0.05)，隨著時間延長，在8h點達最高峰(為對照組的1.8倍)，此后一直顯著高于對照組(P<0.01)。A549細胞PAR2蛋白表達量也在4h時顯著升高(P<0.05)，在8h點達最高峰(為對照組的2.2倍)，此后一直顯著高于對照組(P<0.01)。A549細胞經海水處理后，上清液中的IL-8和TNF-α迅速升高，2 h達最高峰，顯著高于對照組(P<0.01)。此后有所下降，但在所有時間

10、點均顯著高于對照組(P<0.01)。 2.與正常對照組比較，海水處理后，A549細胞p38MAPK磷酸化水平、ERK磷酸化水平和JNK磷酸化水平顯著升高(分別為對照組的3.1倍、1.8倍和3.2倍)(P<0.01-0.05)，NF-κB活化水平顯著升高(為對照組的6.7倍)(P<0.01)，而FUT-175和PAR2抗體預處理組同海水處理組比較，A549細胞p38MAPK磷酸化水平、JNK磷酸化水平、ERK磷酸化水平和NF-κB

11、活化水平顯著降低(P<0.01-0.05)。海水處理后，A549細胞培養(yǎng)上清液中IL-8和TNF-α顯著升高(P<0.01)，而FUT-175、PAR2抗體、SB203580、PD98059和SP600125預處理組同海水處理組比較，上清液中IL-8和TNF-α則顯著降低(P<0.01)。 3.與正常對照組比較，海水吸入后，大鼠肺組織PAR2 mRNA和蛋白表達量在2h時即顯著升高(P<0.05)，隨著時間延長，在4h點達最高峰

12、(為對照組的2.8倍)，此后均顯著高于對照組(P<0.01)。同時大鼠肺組織PAR2蛋白表達量在2h時即顯著升高(P<0.05)，隨著時間延長，在4h點達最高峰(為對照組的4.2倍)，此后均顯著高于對照組(P<0.01)。PAR2免疫組化顯示，在正常對照組，PAR2微弱表達于肺泡、支氣管上皮和肺泡巨噬細胞，海水吸入2h后，陽性反應明顯增強，不僅見于肺泡和支氣管上皮細胞，還見于肺微血管內皮細胞和氣道平滑肌細胞。 4.與正常對照組比

13、較，海水和LPS吸入致傷組大鼠PaO2下降、W/D比值增大、肺微血管通透性增高、肺組織MPO活性增高、血漿IL-8和TNF-α升高、肺組織病理形態(tài)學積分增加(P<0.01)；海水組PaO2明顯低于LPS組，而MPO、W/D和PVMP明顯高于LPS組(P<0.01)。FUT-175治療海水吸入組上述指標均顯著改善(P<0.01-0.05)。 結論： 1.海水處理A549細胞，可上調A549細胞PAR2的表達，導致IL-8和

14、TNF-α釋放的增加，同時可導致A549細胞結構的改變。 2.海水激活A549細胞PAR2后，通過MAPK信號通路和NF-B信號通路，導致IL-8和TNF-α釋放增加，是海水處理A549細胞導致細胞損傷的可能機制。 3.絲氨酸蛋白酶抑制劑FUT-175和PAR2抗體可通過抑制PAR2的激活，對海水處理的A549具有保護作用。 4.海水吸入后大鼠肺組織PAR2表達上調，在海水所致急性肺損傷中起重要作用。 5