A20抑制TNF-α誘導的肝癌細胞的遷移.pdf

1、目的:
　　通過一系列實驗我們初步證明A20可抑制TNFa增強的腫瘤細胞的運動能力，并且是通過影響EMT和FAK來實現(xiàn)的。
　　方法:
　　一、采用肝癌臨床標本檢測A20的表達與肝癌轉移的相關性。
　　二、選擇確定及培養(yǎng)A20高表達細胞株和低表達細胞株
　　三、A20對肝癌細胞系運動能力的作用及其機制研究
　　四、體內實驗驗證A20對肝癌細胞運動性的作用
　　結果:
　　一、A20與肝癌的

2、轉移具有相關性
　　在肝癌病人組織芯片中，75例病人的肝癌組織和癌旁組織檢測A20的表達差異，選擇相應視野通過統(tǒng)計分析得出A20在癌旁組織中的表達顯著高于其在肝癌組織中的表達(P＜0.001)。
　　我們探究A20能否抑制肝癌的轉移，選用106例肝癌病人組織切片進行免疫組化雙染，目的蛋白為A20和血管內皮CD34，其中A20被染成棕色，CD34被染成紅色。其中有89例肝癌病人組織切片可以觀察到腫瘤細胞的微血管侵犯。統(tǒng)計分析可

3、以得出進入到血管中的腫瘤細胞其A20的表達顯著低于未侵入血管中的腫瘤細胞A20的表達(P＜0.001)。這提示A20可能對肝癌細胞的轉移起到抑制作用。
　　為了進一步確定侵入血管中的是腫瘤細胞而不是其他間質細胞，我們采用組化雙染，靶蛋白為CD34和角蛋白CK8/18，其中CK8/18蛋白染成棕色，CD34被染成紅色。結果發(fā)現(xiàn)侵入血管中的細胞可表達角蛋白CK8/18，這表明侵入血管中的細胞是腫瘤細胞。
　　二、肝癌細胞系中A2

4、0表達差異的鑒定
　　我們選用五種肝癌細胞系SMMC-7721、HEL-7402、huh-7、Hep-3B、HCCLM3通過蛋白水平檢測Hep-3B為A20高表達細胞株，SMMC-7721、HEL-7402、huh-7、HCCLM3為A20低表達細胞株。因此在體外實驗過程中我們選用SMMC-7721、huh-7構建A20過表達體系，選用Hep-3B進行A20干擾使其低表達。在體內實驗時選用肝癌細胞高轉移細胞系HCCLM3構建腫瘤模

5、型。
　　三、A20能夠抑制TNFα誘導的肝癌細胞的侵襲和遷移
　　體外實驗驗證A20對肝癌侵襲和遷移實驗的研究采用細胞跨膜的方法即transwell小室來實施:結果顯示在TNFa刺激下，當高表達A20時，A20能夠抑制肝癌細胞的遷移和侵襲能力:當干擾A20表達后，干擾組的肝癌細胞其遷移和侵襲能力則會增強。然而，在未刺激組無論A20表達高低與否，其對肝癌細胞的運動能力沒有作用。因此我們認為A20可抑制由TNFa誘導的肝癌細胞

6、的運動能力。
　　四、A20主要通過影響EMT進程和FAK的活化來抑制肝癌細胞的運動能力
　　對其機制研究發(fā)現(xiàn):首先A20是典型的NF-κB抑制劑，它能抑制TNFa引起的NF-κ B的活化。隨后通過查閱文獻我們猜想:A20可能通過影響肝癌細胞的EMT進程和FAK-RAC1通路來抑制TNFα誘導的肝癌細胞的侵襲和遷移。我們選取A20過表達和低表達兩種細胞體系來驗證猜想。首先，實驗發(fā)現(xiàn)A20能抑制TNFa誘導的肝癌細胞的EMT進

7、程，即在蛋白水平和RNA水平均能上調E-cad，下調N-cad。隨后，我們阻斷NF-κ B通路，發(fā)現(xiàn)A20抑制EMT相關分子的現(xiàn)象消失了。說明A20通過阻斷NF-κ B通路來抑制TNFa誘導的肝癌細胞EMT進程。其次，實驗發(fā)現(xiàn)A20可以降低TNFa誘導的FAK的磷酸化水平，同時降低了FAK下游的RAC1-GTP活性。我們還發(fā)現(xiàn)當沉默RIPK1表達后A20對TNFa誘導的FAK活化的抑制作用明顯減弱了，這表明A20可能通過對RIPK1的泛

8、素化降解，影響RIPK1和FAK的結合，進而抑制FAK的活化。而在未刺激組中無論A20表達高低與否，其對EMT分子和FAK、RAC1的表達均無明顯作用。綜上所述，我們認為A20可通過抑制TNFa引起的NF-κ B的活化來阻礙肝癌細胞的EMT進程，還可以通過RIPK1來阻斷FAK-RAC1通路的活化，從而最終抑制TNFa誘導的肝癌細胞的運動能力。
　　五、體內實驗驗證A20對肝癌運動能力的作用
　　在體外細胞實驗已證明A20可

9、以通過作用于EMT和FAK抑制TNFa誘導的肝癌細胞的運動能力，因此我們通過裸鼠皮下成瘤實驗來進一步驗證A20的功能。實驗結果顯示，與對照組（注射空白載體pRK5）相比，實驗組（注射pRK5-A20質粒）腫瘤細胞微血管侵犯的數(shù)量顯著減少。這表明A20對肝癌運動能力的抑制作用。
　　結論:
　　一、A20抑制由TNFa誘導的肝癌細胞的運動能力。
　　二、A20通過影響EMT進程來抑制TNFa誘導的肝癌細胞的運動能力。