組蛋白甲基化修飾在HBV誘導肝細胞基因表達改變中的作用機制研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染可以導致急/慢性肝炎、肝硬化及肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的發(fā)生,這些疾病都嚴重威脅著全人類的健康。全世界范圍內(nèi)大約有3.5億人為慢性乙型肝炎患者,我國HBV感染者也接近1.2億。HBV感染的免疫學機制研究一直以來受到研究者的密切關注,近些年,HBV相關的表觀遺傳學致病機制的研究也逐漸成為研究的熱點。為了支持

2、自身的復制和存活, HBV感染宿主細胞后改變了宿主基因的表達,而且促進了肝細胞的損傷。但是,這種潛在的作用機制仍然沒有完全被了解釋清楚。有研究提示組蛋白 H3的第4位賴氨酸三甲基化(trimethylated histone H3 lysine4,H3K4me3)修飾與基因活化相關,而組蛋白H3的第27位賴氨酸三甲基化(trimethylated histone H3 lysine27,H3K27me3)修飾與基因沉默相關。因此,我們將

3、從表觀遺傳學的角度出發(fā),以HepG2.2.15和HepG2細胞為細胞模型,通過染色質(zhì)免疫共沉淀-高通量測序(chromatin immunoprecipitation-sequencing,ChIP-Seq)方法,研究H3K4me3和H3K27me3修飾在HBV誘導相關致病基因表達改變中的作用機制,對 HBV誘導肝細胞表觀遺傳學改變后導致疾病發(fā)生、發(fā)展的相關機制進行闡述,為乙型肝炎新的治療策略提供理論依據(jù)。
　　實驗方法:

4、　　按相應的要求培養(yǎng)HepG2.2.15和HepG2細胞,通過RNA-測序(RNA-sequencing, RNA-Seq)和 ChIP-Seq技術分別獲得兩種細胞的數(shù)字基因表達譜( digital gene expression profiling,DGE)及相應的組蛋白甲基化修飾譜。通過生物信息學的分析可獲得 HBV相關的差異基因表達譜。依據(jù)文獻提供的基因功能,挑選特異性的疾病相關差異表達基因按基因的功能進行分類分析。分別收集相應的

5、臨床肝活檢組織,包括未治療的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)病人31例,已經(jīng)用替比夫定治療(600mg每天,口服)兩年的8例,HBV病毒陰性的7例(作為健康人對照(health control, HC))。按相應的要求培養(yǎng) HepG2.2.15、HepG2及 HepG2.2.15-T(經(jīng)替比夫定處理)細胞作為實驗的細胞模型。通過實時定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polyme

6、rase chain reaction, QPCR)技術分別檢測細胞和肝組織中 HBV共價閉合環(huán)狀 DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的表達水平。利用QPCR及染色質(zhì)免疫共沉淀-實時定量聚合酶鏈反應( chromatin immunoprecipitation- quantitative real time polymerase chain reaction,ChIP-QPCR)技術分別

7、從細胞水平和組織水平,對HBV相關疾病基因的表達情況和組蛋白甲基化修飾情況進行檢測驗證。對檢測的數(shù)據(jù)進行相關性統(tǒng)計分析。利用GraphPad Prism software4.0軟件對相關的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,通過雙側(cè)T檢驗分析兩種細胞中的信使RNA(message RNA,mRNA)的表達差異和組蛋白甲基化差異,當P值≤0.05認為有差異有顯著性統(tǒng)計學意義。
　　實驗結(jié)果:
　　(1)首先我們通過RNA-測序技術分別獲得Hep

8、G2.2.15和HepG2兩種細胞的數(shù)字基因表達譜。發(fā)現(xiàn) HBV可以引起宿主細胞大量基因表達的改變,這些基因中一些表現(xiàn)為表達上調(diào),另外一些表現(xiàn)為表達下調(diào)。
　　(2)我們通過ChIP-Seq技術分別獲得HepG2.2.15和HepG2兩種細胞的組蛋白甲基化修飾譜。發(fā)現(xiàn) HBV可以引起宿主細胞大量基因座的組蛋白甲基化修飾改變,而且HBV誘導的組蛋白甲基化修飾改變與宿主基因表達改變之間有密切的相關性。
　　(3)通過對 HepG

9、2.2.15和 HepG2兩種細胞的數(shù)字基因表達譜進一步分析獲得了HBV相關的差異基因表達譜,這些差異表達基因(differentially expressed gene,DEG)中許多與HBV相關疾病有著密切的關系。提示了HBV改變宿主基因表達的改變在它的致病中起到了作用。
　　(4)我們選取代表性的差異表達基因,按基因的功能進行了分類分析。發(fā)現(xiàn)這些差異表達基因中許多基因與 HBV進入宿主細胞、宿主細胞的炎癥、肝臟纖維化和成瘤性

10、都有著密切的關系,提示 HBV可能通過改變相關致病基因的表達而導致疾病的發(fā)生。我們的研究中還發(fā)現(xiàn),用抗HBV藥物替比夫定處理HepG2.2.15細胞后可以將H3K4me3的修飾水平充分地修復到HepG2未經(jīng)HBV轉(zhuǎn)導時的修飾水平。同樣的,我們在臨床肝活檢組織(健康人對照和慢性乙型肝炎患者)中也得到了相同的結(jié)果,替比夫定在顯著抑制 HBV復制的同時,很大程度上修復了這些重要基因的組蛋白甲基化修飾,尤其是H3K4me3的修飾水平。提示替比夫

11、定對HBV感染患者的治療作用可能是通過表觀遺傳學機制來實現(xiàn)的。
　　(5)在研究中我們還發(fā)現(xiàn),HepG2細胞無論在有沒有HBV存在的情況下,特異性組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶SMYD3和EZH2的表達水平并沒有明顯的差異。提示HBV誘導宿主基因的組蛋白甲基化修飾水平的改變并不是通過調(diào)節(jié)組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶的表達來實現(xiàn)的。
　　結(jié)論:
　　從我們的研究數(shù)據(jù)中可以發(fā)現(xiàn) HBV可以引起宿主細胞大量基因座的組蛋白甲基化修飾的改變,而且這些

12、基因的表達水平也發(fā)生了相應的改變,在這些基因基中有許多基因與 HBV進入宿主細胞、宿主細胞的炎癥、肝臟纖維化和成瘤性都有著密切的關系。有趣的是,在我們的研究中發(fā)現(xiàn)用抗HBV藥物替比夫定處理HepG2.2.15細胞后,可以將H3K4me3的修飾水平充分地修復到HepG2未經(jīng)HBV轉(zhuǎn)導時的修飾水平。更重要的是,我們在臨床肝活檢組織(健康人對照和慢性乙型肝炎)中也發(fā)現(xiàn),替比夫定不僅糾正了 HBV相關靶基因的表達,而且在很大程度上修復了這些重要

13、基因的H3K4me3修飾水平。另外,HepG2細胞無論在有沒有HBV存在的情況下,特異性組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶SMYD3和EZH2的表達水平并沒有明顯的差異。因此,我們的研究數(shù)據(jù)表明,HBV感染肝細胞后可以誘導宿主細胞發(fā)生異常的組蛋白修飾改變,隨之疾病相關基因的表達水平也發(fā)生了改變,這些改變可能很大程度上參與了 HBV誘導肝癌的形成,而且替比夫定在很大程度上可以使這些改變得到逆轉(zhuǎn)。因此,從表觀遺傳學角度可以說明,替比夫定的治療可能對 HBV