人結(jié)腸癌干細胞樣腫瘤細胞向血管內(nèi)皮細胞方向誘導分化的研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　結(jié)腸癌是危害人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢。研究認為，腫瘤血管對腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移具有重要作用，抗血管生成治療已成為腫瘤治療重要手段，但臨床報道部分病人抗血管生成治療效果不佳，甚至促進腫瘤進展。
　　腫瘤組織中存在一小部分具有自我更新和多向分化潛能的細胞，該細胞雖只占少部分，但與腫瘤的侵襲性生長、復發(fā)、耐藥性密切相關(guān)，這一小部分腫瘤細胞被稱為干細胞樣腫瘤細胞。已有研究表明，在膠質(zhì)母

2、細胞瘤中發(fā)現(xiàn)某些血管內(nèi)皮細胞來源于干細胞樣腫瘤細胞，提示在腫瘤形成過程中干細胞樣腫瘤細胞具有腫瘤血管生成細胞的作用，可直接參與腫瘤微循環(huán)血管網(wǎng)的形成。血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry, VM)是新發(fā)現(xiàn)的一種通過非內(nèi)皮細胞襯覆的管道而形成的特殊血液供應模式。我們的前期研究已發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中存在VM現(xiàn)象，且VM的存在可能與腫瘤細胞的“干性”密切相關(guān)。因此，本研究將結(jié)腸癌細胞在特定微環(huán)境下培養(yǎng)，分析結(jié)腸癌細胞形態(tài)變化與分

3、化程度的關(guān)系，及其與干細胞特性的關(guān)系，并篩選干細胞樣腫瘤細胞，將其誘導分化，推測干細胞樣腫瘤細胞可以模擬內(nèi)皮細胞功能形成VM，進一步在特定環(huán)境下分化成為具有內(nèi)皮細胞特異性分子標記的內(nèi)皮細胞。這對豐富結(jié)腸癌血管生成理論，及解決臨床抗血管藥物耐藥現(xiàn)象具有重要意義。
　　方法:
　　1)三種不同分化程度的結(jié)腸癌細胞HCT116、SW480和HT29置于37℃，5％CO2孵化箱常規(guī)培養(yǎng)。
　　2)取生長旺盛的三種結(jié)腸癌細胞，在

4、含有內(nèi)皮細胞誘導因子的條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每天觀察細胞形態(tài)變化。
　　3)利用Western bloting方法分析三種結(jié)腸癌細胞在含有內(nèi)皮細胞誘導因子的條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，其內(nèi)皮細胞標志物表達情況。
　　4)利用Western bloting和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription polymerasechain reaction，RT-PCR)分別檢測結(jié)腸癌HCT116細胞隨著誘導天數(shù)的延長，內(nèi)皮

5、細胞特異性分子標記在蛋白水平和mRNA水平表達的變化。
　　5)利用細胞免疫熒光方法檢測經(jīng)過內(nèi)皮誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)的HCT116細胞和普通 HCT116細胞，內(nèi)皮細胞特異性分子標記的原位表達的變化。
　　6)將干性較強的HCT116細胞進行無血清懸浮法篩選干細胞樣腫瘤細胞，利用細胞免疫熒光檢測篩選的HCT116干細胞球干細胞相關(guān)分子CD133和Lgr5的表達情況。
　　7)將篩選的HCT116干細胞球置于內(nèi)皮誘導培養(yǎng)基中，

6、通過Western bloting和免疫熒光檢測篩選的HCT116干細胞球在內(nèi)皮誘導培養(yǎng)基及普通培養(yǎng)基中內(nèi)皮細胞特異性分子標記的表達變化。
　　8)進一步采用Matrigel三維培養(yǎng)模型觀察內(nèi)皮誘導培養(yǎng)基對HCT116干細胞球體外成管能力的影響。
　　結(jié)果:
　　1)在內(nèi)皮誘導培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)的三種結(jié)腸癌細胞，隨著誘導時間的延長，低分化的HCT116細胞逐漸貼壁，呈多角形，細胞長滿后呈“鋪路石”樣結(jié)構(gòu)，第15天，細胞呈

7、現(xiàn)“管道”樣結(jié)構(gòu)。中分化的SW480細胞由短梭形逐漸呈長梭形，細胞長滿后有形成“管道”樣的趨勢，但不明顯。高分化的HT29細胞經(jīng)過血管內(nèi)皮誘導培養(yǎng)基持續(xù)誘導半個月，基本無變化。
　　2)Western bloting結(jié)果顯示，三種結(jié)腸癌細胞經(jīng)過內(nèi)皮誘導培養(yǎng)基誘導15天后，分化差的HCT116細胞CD31、CD34表達增強最顯著(P＜0.05)，而中分化的SW480細胞和高分化的HT29變化并不明顯。
　　3)根據(jù)Wester

8、n bloting、 RT-PCR結(jié)果和細胞免疫熒光結(jié)果顯示，結(jié)腸癌HCT116細胞在內(nèi)皮誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)數(shù)天后，隨著誘導天數(shù)的延長，其內(nèi)皮細胞特異性分子標記表達量逐漸增強。
　　4)根據(jù)細胞免疫熒光結(jié)果顯示，篩選的HCT116干細胞球的可以表達干細胞相關(guān)分子CD133和Lgr5。
　　5)根據(jù)Western bloting和細胞免疫熒光結(jié)果顯示，篩選的HCT116干細胞球在內(nèi)皮誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)數(shù)天后，隨著誘導天數(shù)的延長，其內(nèi)皮

9、細胞特異性分子標記表達強度逐漸增強。
　　6)Matrigel三維培養(yǎng)模型觀察結(jié)果顯示，HCT116干細胞球在內(nèi)皮誘導培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基培養(yǎng)進行對比分析表明:三維培養(yǎng)條件下，經(jīng)內(nèi)皮誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)可以促進HCT116干細胞形成管道樣結(jié)構(gòu)，并縮短其形成管道樣結(jié)構(gòu)的時間。
　　結(jié)論:
　　1)結(jié)腸癌細胞具有在體外內(nèi)皮誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)后進行定向誘導的能力。
　　2)結(jié)腸癌細胞在內(nèi)皮誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)數(shù)天后，其細胞形態(tài)的變化及內(nèi)

10、皮細胞特異性分子標記表達變化與分化程度呈負相關(guān)。分化程度低的結(jié)腸癌細胞，經(jīng)過誘導逐漸形成“管道”樣結(jié)構(gòu)，且內(nèi)皮細胞特異性分子標記表達變化最顯著，分化程度高的形態(tài)及內(nèi)皮特異性分子標記表達基本無變化。
　　3)結(jié)腸癌細胞HCT116在內(nèi)皮誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)數(shù)天后，其內(nèi)皮細胞特異性分子標記表達量增強，表明結(jié)腸癌細胞具有向血管內(nèi)皮細胞方向分化的特性。
　　4)血管內(nèi)皮誘導培養(yǎng)基能促進具有較強干細胞樣特性的結(jié)腸癌細胞向血管內(nèi)皮細胞方向分化