內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導自吞噬對脂多糖誘導HL-1心肌細胞損傷保護機制的研究.pdf

1、膿毒血癥是以多器官功能衰竭和心血管抑制為特征的全身炎性反應綜合癥,臨床研究證明心臟功能抑制顯著增加膿毒血癥病人的死亡率。在細胞水平的研究發(fā)現(xiàn)心肌細胞凋亡和能量代謝障礙是膿毒血癥中心血管功能衰竭的重要機制。
　　在膿毒血癥心肌細胞中發(fā)現(xiàn)了自吞噬體增加、線粒體損傷以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的現(xiàn)象,并且有研究發(fā)現(xiàn)這三者之間存在互為因果的關(guān)系。自吞噬是真核細胞內(nèi)進化過程高保守的分解代謝過程,包括降解長壽蛋白和清除老化受損細胞器,最終的降解產(chǎn)物參與新的

2、能量代謝。近年來研究發(fā)現(xiàn),自吞噬選擇性地清除受損的線粒體有利于細胞穩(wěn)態(tài)的維持,促進應激狀態(tài)下的細胞存活。線粒體是細胞內(nèi)能量代謝的主要場所,并參與調(diào)節(jié)細胞凋亡途徑的調(diào)節(jié)。線粒體的質(zhì)量控制依賴受損/老化線粒體的修復/清除和線粒體生物合成之間的動態(tài)平衡,但是在膿毒血癥心肌細胞中自吞噬對線粒體再生的影響還需進一步的研究。雖然很多研究已經(jīng)證明未內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的適應性未折疊蛋白反應參與了自吞噬的發(fā)生,但這個觀點在膿毒血癥心肌細胞中未見報道。
　　

3、通過建立 HL-1心肌細胞膿毒血癥模型,研究自吞噬的表達、發(fā)生和自吞噬抗細胞凋亡的保護機制,為膿毒血癥心臟功能衰竭提供臨床治療靶點。
　　本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 脂多糖誘導自吞噬對 HL-1心肌細胞凋亡的影響
　　目的:研究脂多糖誘導 HL-1心肌細胞自吞噬表達及自吞噬對心肌細胞的保護作用。
　　方法:建立 HL-1心肌細胞膿毒癥模型,脂多糖以1ug/ml終濃度干預 HL-1心肌細胞。應用

4、蛋白免疫印跡方法觀察脂多糖干預 HL-1心肌細胞2、4、8、16、24h的LC3II蛋白的表達時程;在脂多糖干預4和24h,通過透射電子顯微鏡和共聚焦顯微鏡觀察自吞噬體的形成,實時定量聚合酶鏈反應檢測 ATG5和ATG7mRNA的表達評估自吞噬活性,通過流式細胞儀檢測細胞凋亡。3-甲基嘌呤(3-MA)和納巴霉素(Rap)預處理48h后,分別觀察脂多糖干預4和24h心肌細胞凋亡和LC3II蛋白表達。
　　結(jié)果:脂多糖干預 HL-1心

5、肌細胞2h后 LC3II開始上調(diào),4h達到高峰,24h減弱;共聚焦顯微鏡顯示,脂多糖干預4h后出現(xiàn)綠色熒光斑點物質(zhì)出現(xiàn)聚集,24h減弱;電子顯微鏡顯示在脂多糖干預4h,出現(xiàn)了雙膜或多膜結(jié)構(gòu)的自吞噬體,而在24h減少。ATG5和ATG7mRNA表達在脂多糖干預后4h上調(diào),同樣在24h下降。3-MA預處理后,誘導了脂多糖干預4h的細胞凋亡。Rap預處理后,抑制了脂多糖在24h誘導的細胞凋亡。
　　結(jié)論:脂多糖在 HL-1心肌細胞誘導了

6、自吞噬,表現(xiàn)為早期增強,而晚期表現(xiàn)為下降。自吞噬在膿毒癥中表現(xiàn)為細胞保護作用。
　　第二部分 脂多糖誘導自吞噬對 HL-1心肌細胞線粒體功能影響的研究
　　目的:研究膿毒血癥心肌細胞中自吞噬線粒體功能和線粒體再生的影響。
　　方法:建立HL-1心肌細胞內(nèi)毒素血癥模型。在脂多糖干預24h后,通過電子顯微鏡、流式細胞儀和實時定量聚合酶鏈反應技術(shù)觀察線粒體面積和光密度,線粒體膜電位,線粒體再生基因 Tfam和PGC-1a的變

7、化評估線粒體功能。脂多糖干預前,3-甲基嘌呤(3-MA)和納巴霉素(Rap)預處理48h,觀察線粒體功能及線粒體再生的變化。
　　結(jié)果:HL-1心肌細胞在脂多糖干預24h后,線粒體面積和光密度增加,線粒體膜電位下降,并伴隨線粒體再生基因 Tfam和PGC-1amRNA表達下調(diào)。3-MA預處理下調(diào)自吞噬的表達,加重了脂多糖對線粒體功能的損傷和進一步抑制了線粒體再生基因的表達。納巴霉素預處理,上調(diào)自吞噬的表達,減輕了脂多糖對線粒體功能

8、的損傷,同時線粒體再生功能上調(diào)。
　　結(jié)論:脂多糖在 HL-1心肌細胞導致了線粒體超微結(jié)構(gòu)的損傷和線粒體膜電位下降,抑制了線粒體的再生功能。抑制自吞噬,加重了脂多糖對線粒體的損傷,上調(diào)自吞噬,減輕了脂多糖對線粒體功能的損傷。自吞噬在 HL-1心肌細胞內(nèi)毒素血癥中對線粒體功能起到保護作用。
　　第三部分 脂多糖在 HL-1心肌細胞誘導自吞噬發(fā)生機制的研究
　　目的:研究在 HL-1心肌細胞中脂多糖是否通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導自

9、吞噬。
　　方法:建立HL-1心肌細胞脂多糖內(nèi)毒血癥模型。通過實時定量聚合酶鏈反應檢測脂多糖干預4、24h和對照組 GRP78和IRE1amRNA表達,觀察脂多糖誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的變化。衣霉素(Tm)和?；敲撗跄懰?TUDCA)預處理后,通過實時定量聚合酶鏈反應、蛋白免疫印跡和共聚焦顯微鏡觀察脂多糖干預 HL-1心肌細胞4h后,GRP78、IRE1a、ATG5和ATG7mRNA,LC3II蛋白印跡和綠色 LC3II熒光顆粒的表達評估

10、的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和自吞噬變化的關(guān)系。
　　結(jié)果:脂多糖在 HL-1心肌細胞中誘導了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激,與對照組比較, GRP78和IRE1amRNA在干預后4h表達上調(diào),24h表達下降。與對照組比較,衣霉素誘導了GRP78和IRE1amRNA、LC3II蛋白印跡和綠色 LC3II熒光表達顆粒上調(diào);與脂多糖干預4h組比較,衣霉素增強了脂多糖誘導的GRP78和IRE1a的表達,同時進一步增加了LC3II蛋白印跡和綠色 LC3II熒光顆粒的表達。牛