胰島移植治療糖尿病的臨床前研究.pdf

1、糖尿病是對人類生命健康危害最為嚴重的疾病之一。胰島移植是二十世紀七十年代建立的一種治療糖尿病的技術方法，特別是本世紀采用Edmonton胰島方案以來，胰島移植已經發(fā)展成為一項成熟的技術，成為糾正糖代謝紊亂，防治并逆轉糖尿病慢性并發(fā)癥的有效方法。 目的：建立人胰島分離、純化和功能評價的技術方案，并應用該方案對所分離和純化的人胰島進行體內、外功能的評價和安全性評估，為開展臨床胰島移植奠定基礎，為并申報胰島細胞治療臨床準入批文提供系統

2、的數據資料。 方法：獲得成人尸體胰腺供體6例，采用膠原酶消化法及密度梯度離心法分離和純化人尸體胰腺供體的胰島，經雙硫腙(DTZ)染色計數并分析胰島細胞的純度。通過AO/PI染色評價分離胰島的活力；通過電子顯微鏡觀察胰島素分泌顆粒；采用免疫熒光染色分析分離胰島的細胞組成和分布：通過RT-PCR檢測分離胰島主要激素和自身抗原mRNA的表達；通過靜態(tài)葡萄糖刺激檢測胰島素分泌功能；將分離的人胰島移植到糖尿病小鼠評價胰島的代謝功能；并對分

3、離胰島的產品進行細菌污染，內毒素含量和凝血活性等安全性指標的檢測。 結果：成人尸體胰腺供體6例，冷缺血時間10-12個小時，胰腺重量65.61±19.31(41.30-94.87)g，未消化組織重量15.09±8.21(7.44-26.85)g，消化組織的重量為50.52±19.56(33.86-83.45)g：分離純化后胰島的數量為22.9±3.1萬IEQs(4970±1620IEQs/g組織)；經不連續(xù)密度梯度純化后，胰島的

4、純度為59.0％±8.9％(49％-70％)；吖啶橙/碘化丙啶(AO/PI)染色顯示，分離胰島的活力為89％±3％(85％-94％)；RT-PCR表明，分離胰島的胰島素、胰高糖素、IA2、IAR、ICAp69以及GAD65mRNA表達陽性；靜態(tài)葡萄糖孵育刺激胰島素釋放的刺激指數(SI)為8.1±4.0(3.8-10.2)；透射電鏡掃描可見分離的胰島細胞中有大量的胰島素分泌顆粒；冰凍切片的免疫熒光染色顯示分離胰島中C-肽(C-peptid

5、e)陽性細胞占大多數，主要分布于胰島的中心部位，胰高糖素(glucagon)陽性細胞次之，主要分布在胰島的周邊部位，生長抑素(somatostatin)陽性細胞較少，主要散在分布于胰島內，胰多肽(pancreaticpolytide)陽性細胞很少，主要分布于胰島的周邊；凍存復蘇后的胰島經AO/PI染色觀察胰島的活力為85％；凍存復蘇后的胰島經靜態(tài)葡萄糖刺激后，胰島素分泌的刺激指數為2.5；將分離純化后的人胰島移植于鏈脲菌素(STZ)制備

6、糖尿病裸鼠的左腎包膜下，發(fā)現治療組血糖3天后降至正常水平并長期保持；切除接受了胰島移植的左側腎臟后，糖尿病裸鼠的血糖明顯升高；對分離胰島的培養(yǎng)上清進行細菌培養(yǎng)的檢測，結果為陰性，胰島培養(yǎng)上清中內毒素含量＜0.5EU/ml，凝血活性＜300U/ml。這些結果和技術指標已經全面達到或超過美國邁阿密胰島移植中心和賓夕法尼亞胰島移植中心的技術指標。 結論：采用我們制定的胰島分離、純化技術方案所分離的人胰島在形態(tài)、結構、數量、純度、活力、