TNF-α、TNFR及NF-κB基因多態(tài)性與社區(qū)獲得性肺炎易感性及嚴重程度的相關性研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　社區(qū)獲得性肺炎（Community acquired pneumonia，CAP）是常見的感染性疾病，一般 CAP患者經數(shù)天的抗感染治療即可基本痊愈，然而也有部分患者病情迅速發(fā)展，最后因出現(xiàn)急性肺損傷或感染性休克而死亡。肺炎患者病情差異的原因眾多，基因背景是重要的影響因素之一，不同的基因背景可能影響個體感染病原菌后的炎癥反應強度。炎癥反應是機體清除病原微生物或非己成份的防御反應，但過度的炎癥反應可損傷機體正常

2、組織細胞，引起器官功能不全。CAP誘發(fā)急性肺損傷的本質是肺局部過度激活的炎癥反應損傷肺實質與間質，肺換氣功能受損繼而出現(xiàn)難以糾正的低氧血癥。炎癥通路分子的過度活化與炎癥介質的不恰當釋放是炎癥反應過度激活的原因。炎癥反應通路關鍵分子與炎癥介質基因多態(tài)性，可能從遺傳的層面上決定了不同個體對感染誘發(fā)炎癥反應強度的差異性，最終影響疾病的嚴重程度及預后。
　　基因的多態(tài)性現(xiàn)象是在遺傳層面上影響基因表達的因素。基因多態(tài)性是指在一個生物群體中，

3、同時和經常存在兩種或多種不連續(xù)的基因型或等位基因，對于個體而言，等位基因的堿基序列終生不變，并按孟德爾規(guī)律世代相傳?；蚨鄳B(tài)性不僅影響遺傳性疾病的發(fā)病率，還可能干預機體對感染性疾病的易感性和預后，而且基因多態(tài)性是基因的固有特征，不受機體的生理狀態(tài)與壽命影響。因此對CAP患者穩(wěn)定的基因多態(tài)性進行檢測可以對CAP嚴重程度及預后進行判斷，并以此作為制訂和調整治療方案的依據(jù)。
　　活化炎癥反應的信號分子眾多，腫瘤壞死因子α(Tumor N

4、ecrosis Factor alpha，TNF-α)、腫瘤壞死因子受體（Tumor Necrosis Factor Receptor，TNFR）及核因子kappa B（Nuclear factor kappa B，NF-κB）是炎癥反應激活和放大過程的關鍵分子，在感染所引發(fā)的炎癥反應中起重要作用。機體在致炎因素的作用下通過炎癥反應通路引起初次的TNF-α釋放，此釋放后的TNF-α與炎癥細胞表面的TNFR結合，向下激活NF-κB，由NF

5、-κB調節(jié)其他炎癥介質的表達，如IL-6、IL-1β等，提高了炎癥反應強度；NF-κB也促進TNF-α的釋放，此部分TNF-α再次與TNFR結合，再次活化炎癥反應通路，產生級聯(lián)放大作用，形成正反饋放大炎癥反應。NF-κB是調節(jié)炎癥介質表達的重要轉錄因子，其非編碼區(qū)內若干核苷酸的插入或缺失影響NF-κB對炎癥反應的調節(jié)活性。TNF-α與 TNFR結合能放大炎癥反應和介導細胞死亡，二者的基因啟動子存在的多態(tài)性位點可能影響二者的表達量，從而影

6、響炎癥反應強度。
　　鑒于TNF-α、TNFR及NF-κB在重癥肺炎的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用，且國內外尚少見TNF-α、TNFR及NF-κB基因多態(tài)性與 CAP易感性及嚴重程度相關性的報道，通過研究 TNF-α、TNFR及NF-κB基因多態(tài)性，預測機體對CAP易感性、嚴重程度及預后有重大意義。
　　本實驗采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction

7、fragment length polymorphism，PCR-RFLP）、采用聚合酶鏈反應-高分辨率熔解曲線法(polymerase chain reaction-high resolution melting curve，PCR-HRM)及基因測序技術檢測中國廣東漢族人群社區(qū)獲得性肺炎患者及健康人群的TNF-α、TNFR及NF-κB基因多態(tài)性分布情況，分析其基因多態(tài)性與肺炎易感性、嚴重程度的相關性，為以期通過炎癥反應通路關鍵分子的

8、基因多態(tài)性分析進行 CAP易感性、嚴重程度及預后預測，指導臨床治療。
　　材料與方法：
　　1、研究對象 CAP組為2010年10月-2011年6月就診于廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院的肺炎患者66例，其中男性37例，女性29例，年齡18-83歲，平均年齡（60.59±14.67）歲；對照組為廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院的健康體檢人群66例，其中男性31例，女性35例，年齡21-83歲，平均年齡(54.62±15.45)歲。兩組人群均為無血緣關系

9、的廣東地區(qū)漢族人，且在性別、年齡上分布沒有差異。根據(jù)2007年 IDSA/ATS關于成人 CAP的診治指南，將 CAP患者分為重癥肺炎組(severe community-acquired pneumonia,SCAP）和非重癥肺炎組（non-SCAP,NSCAP），根據(jù) CURB-65和PSI評分量化肺炎嚴重程度。根據(jù)患者28天內是否存活，分為死亡組和存活組。
　　2、基因組DNA提取及定量各研究對象抽取1mLEDTA抗凝的外周

10、靜脈血，使用基因組DNA提取試劑盒提取DNA，通過Nanodrop2000對提取的基因組DNA進行濃度和純度分析。根據(jù)測定結果將樣本DNA稀釋至30ng/μL的工作液。
　　3、對基因組DNA進行PCR擴增，采用PCR-RFLP、PCR-HRM及基因測序檢測 TNF-α、TNFR及 NF-κB的基因多態(tài)性，并抽樣測序驗證多態(tài)性結果準確性。TNF-α-308G/A、TNFR1-609G/T、TNFR1+36A/G、TNFR2+676

11、T/G的基因多態(tài)性使用PCR-RFLP進行檢測； TNFR2+1663A/G、+1668 T/G、+1690 C/T使用測序法進行檢測。NFκB1-94ins/del ATTG采用PCR-HRM進行檢測。
　　4、統(tǒng)計分析：應用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗，如理論頻數(shù)<5，采用Fisher確切概率法。計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示，非正態(tài)資料以中位數(shù)及四分位數(shù)間距表示。計量資料組間比較采

12、用兩獨立樣本t檢驗。顯著性水平α取0.05。
　　結果：
　　1、TNF-α、TNFR及NF-κB基因多態(tài)性分布情況
　　在CAP組和對照組均未發(fā)現(xiàn)攜帶TNFR1+36GG、TNFR2+1668GG基因型的人群。TNF-α-308G/A、TNFR1+36A/G、TNFR2+676T/G、TNFR2+1663A/G、+1668 T/G、+1690C/T及NFκB1-94ins/delATTG的基因型及等位基因在CAP組和

13、對照組之間的分布差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），TNFR1-609G/T基因型在CAP組和Control組之間的分布差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；其等位基因分布在兩組間差異有統(tǒng)計學意義（P=0.036）。
　　2、TNF-α、TNFR及NF-κB基因多態(tài)性與肺炎嚴重程度的相關性
　　TNF-α-308G/A、TNFR1+36A/G、TNFR2+676T/G及 NFκB1-94ins/delATTG的基因型及等位基因在S

14、CAP組和NSCAP組之間分布差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），TNFR1-609G/T、TNFR2+1690C/T的基因型在SCAP組和NSCAP組之間分布差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），TNFR1-609G/T、TNFR2+1690C/T的等位基因在SCAP組和NSCAP組之間分布差異有統(tǒng)計學意義（P=0.027）。
　　TNF-α-308G/A、TNFR1-609G/T、TNFR1+36A/G、TNFR2+676T/G、T

15、NFR2+1663 A/G、+1668 T/G、+1690C/T及NFκB1-94ins/delATTG多態(tài)性在死亡組和存活組之間分布差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　根據(jù)TNF-α-308G/A、TNFR1-609G/T、TNFR1+36A/G、TNFR2+676T/G、TNFR2+1663A/G、+1668 T/G、+1690C/T及NFκB1-94ins/delATTG的多態(tài)性分類，肺炎患者各組間的住院時間、白細胞數(shù)、

16、中性粒細胞數(shù)、血沉、C-反應蛋白差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　根據(jù) TNF-α-308G/A、TNFR1+36A/G、TNFR1-609G/T、TNFR2+676T/G、TNFR2+1663A/G、+1668 T/G、+1690C/T及NFκB1-94ins/delATTG的多態(tài)性分類，肺炎患者各組間的CURB-65、PSI評分差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　結論：
　　1. TNFR2+1668G等