間充質(zhì)干細胞注射對大鼠退變椎間盤的作用.pdf

1、目的： 分離、擴增并鑒定大鼠間充質(zhì)干細胞，建立并驗證大鼠尾椎間盤退變模型，探討間充質(zhì)干細胞注射對鼠尾椎間盤退變的作用。 方法： 用穿刺抽吸法收集大鼠股骨和脛骨內(nèi)的骨髓，密度梯度離心法和貼壁法分離并純化間充質(zhì)干細胞，進行體外擴增，并用細胞計數(shù)法繪制第一代、第三代和第五代細胞的生長曲線。用流式細胞鑒定檢測第三代細胞表面標記CD90、CD34和CD45表達情況。對第4代細胞進行成骨和成脂誘導分化，并用茜素紅染色鑒定成骨

2、誘導分化結(jié)果，以及用油紅O染色鑒定成脂誘導分化結(jié)果。選取健康3月齡SD大鼠40只，隨機分為對照組(8只)、退變組(8只)、培養(yǎng)基注射組(8只)和實驗組(16只)，并對后三組的Co7/Co8、Co8/Co9和Co9/Co10椎間盤用細針穿刺纖維環(huán)法誘導退變。造模2周后拍攝X光片觀察造模效果，并向?qū)嶒灲M造模椎間盤內(nèi)注射間充質(zhì)干細胞，培養(yǎng)基注射組造模椎間盤內(nèi)注射等體積干細胞培養(yǎng)基，對照組、退變組不予特殊處理。分別于造模后1周、2周、3周、4周

3、抽取4只試驗組大鼠和其他三組大鼠各2只麻醉后拍攝尾椎正位片，測量椎間盤高度，并計算椎間盤高度指數(shù)。放射學檢查后對抽取的大鼠實施過量麻醉處死，取出Co7/Co8椎間盤和相鄰的上下部分椎體，固定、切片，行HE染色和番紅-固綠染色評估椎間盤組織學改變。完整取出Co8/Co9和Co9/Co10椎間盤，分別用1，9-二甲胺基甲基藍結(jié)合法和二甲氨基苯甲醛比色法檢測Co8/Co9椎間盤內(nèi)GAG和羥脯氨酸含量；提取出Co9/Co10椎間盤內(nèi)總RNA后，

4、實時定量PCR檢測其中聚集蛋白聚糖mRNA的表達水平。 結(jié)果： 分離和純化的間充質(zhì)干細胞體外擴增迅速，流式細胞鑒定顯示細胞表達CD90，不表達CD34和CD45。茜素紅染色和油紅O染色證明擴增后的細胞仍具有成骨和成脂分化能力。放射學，生物化學和定量PCR檢查發(fā)現(xiàn)，和對照組相比，退變組和培養(yǎng)基注射組的椎間盤高度、椎間盤內(nèi)GAG含量、聚集蛋白聚糖mRNA表達水平均有不同程度降低(p<0.05)，并表現(xiàn)出隨時間下降的趨勢。而實

5、驗組與退變組相比，上述指標均表現(xiàn)出一定的改善趨勢，注射4周后GAG含量有統(tǒng)計學差異(p<0.05)。組織學觀察到造模后隨時間進展的椎間盤退變過程，實驗組與退變組相比，退變程度相對較輕。椎間盤內(nèi)羥脯氨酸含量，各組間沒有明顯差異(p>0.05)。 結(jié)論： 間充質(zhì)干細胞分離純化相對容易、體外擴增迅速，擴增后仍保持其多向分化潛能。細針穿刺法誘導大鼠尾椎間盤退變模型成模時間短，效果可靠，經(jīng)濟便利。向大鼠鼠尾椎間盤退變模型內(nèi)注射間充