UGT1A3和UGT1A9的異源表達與黃酮類代謝及UGT1A3基因多態(tài)性研究.pdf

1、對有機生物而言，絕大多數(shù)藥物屬于生物異源物質(zhì)，一旦藥物進入機體，就要被機體代謝。葡萄糖醛酸結(jié)合反應是其中一種普遍的II相代謝反應，在此反應中藥物在尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGTs)的催化下，與內(nèi)源性的葡萄糖醛 到目前為止，很多人類UGTs蛋白都已在體外獲得了異源表達，其它種屬UGTs的體外表達也時有報道。但國內(nèi)在此方面豹研究起步較晚。在本文中，我們嘗試中國倉鼠肺成纖維細胞(CHL)和Bac-to-Bacr桿狀病毒感染的昆蟲表

2、達系統(tǒng)，獲得了活性重組UGT1A3和UGT1A9蛋白，并以此比為模型，對重要的tJGrs O-葡萄糖醛酸結(jié)合底物-黃酮類-展開了一系列代謝研究。 一.采用CHL系統(tǒng)和Bac-to-BacR系統(tǒng)表達活性人UGT1A3及UGT1A9uGTs超基因家族，根據(jù)氨基酸序列的同源性，可分為4個亞族：UGTl，UGT2，UGTl3和UGT8。在這些同工酶中，UGT1和UGT2亞族，尤其是前者，與外源物代謝的關(guān)系最為緊密。人類UGT1A基因位于

3、染色體2q37處，至少由13種不同的第一外顯子和4個共同的外顯予2．5組成。本文的研究模型UG"nA3和UGT1A9分別是UGT1A亞族中的第三號和第九號活性蛋白。我們先后嘗試了CHL，和Bac-to-Bacr表達系統(tǒng)，以獲得滿足后續(xù)實驗要求的活性UGT1A3和UGT1A9蛋白。 1．活性UGT1A3在CHL細胞中的異源表達本實驗以病人病灶組織旁的正常肝或胃組織的總RNA為模版，使用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈擴增反應(RT-PCR)獲得U

4、GT1A3*2a基因。該基因與野生型UGT1A3*1基因相比具有3個單核苷酸突變，分別為(T31C，w11R;G81A,E27E和T140C。V47A)。這其中2個是有義突變(T31C，w11R和T140C,V47A)，1個是靜默突變(G81A. E27E)。經(jīng)酶切和測序鑒定后，UGTlA3*2a被亞克隆入哺乳動物表達載體pcDNA3.1(+)，通過改良的磷酸鈣轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)入CHL中進行穩(wěn)定表達。由于pcDNA3.1(+)載體帶有G418抗

5、性基因，我們采用400μg/ml的G418進行篩選，直至未轉(zhuǎn)染組細胞完全死亡。篩選過后，我們以有限稀釋法獲得有抗性的單克隆，并用RT-PCR的方法確證了人UGT1A3*2a基因在單克隆中的表達。將轉(zhuǎn)基因細胞超聲破碎，包含有重組蛋白的細胞破碎液被用于進一步的孵育實驗以測定重組酶的活性。 以槲皮素為底物，在含有尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDPGA)的葡萄糖醛酸體外孵育系統(tǒng)中，重組UGT1A3.2酶代謝槲皮素產(chǎn)生1個槲皮素葡萄糖醛酸苷。該

6、代謝物在孵育液的HPLC分析中被檢測到，其二極管陣列光譜(DAD)與底物槲皮素十分相似，且經(jīng)β-葡萄糖醛酸酶水解后消失，表明重組人UGT1A3*2a在CHL表達系統(tǒng)中獲得了異源活性表達。 2．活性uGT1A3和UGT1A9在Bac-to-Bacr表達系統(tǒng)中的異源表達本實驗以Bac-to-Bacr桿狀病毒感染的Sf9昆蟲表達系統(tǒng)來獲得大量高活性的UGT1A3和UGT1A9重組蛋白。實驗首先以。pcDNA3.1(+)-UGTlA3*

7、2a為模板，經(jīng)過PCR擴增和定點突變獲得需要的UGT1A3*1野生型序列，并通過引物設計插入了6個組氨酸的His-tag序列，將該基因序列連入pFastBacTM1載體中。同時以pcDNA3.1(+)-UGT1A9質(zhì)粒為模板，運用PCR在基因的兩側(cè)加入AflⅡ和XhoI的酶切位點，連入pFastBaeTMl載體，構(gòu)建了pFastBacTM1-UGT1A9重組質(zhì)粒。重組pFastBacTM1-UGTIA9, pFastBacTM1-UGT

8、1A3質(zhì)粒在MAX EfficiencyDHlOBacTm competent Escherichia coli中發(fā)生轉(zhuǎn)座，以。PCR鑒定轉(zhuǎn)座產(chǎn)生的重組粘粒。將重組粘粒與陽離子脂質(zhì)體結(jié)合后轉(zhuǎn)染Sf9細胞，獲得重組桿狀病毒，感染Sf9細胞，72h后收集蛋白，采用RT-PCR和Westernblot進行蛋白表達鑒定。為了檢測表達蛋白的體外活性，我們以槲皮素為底物，對UGT1A3/UGT1A9重組酶進行了酶活性初試。在含有UDPGA的葡萄糖醛

9、酸體外孵育系統(tǒng)中，重組UGT1A3酶和UGT1A9酶均代謝槲皮素產(chǎn)生4個槲皮素葡萄糖醛酸苷，這與人肝微粒體孵育結(jié)果相同。在Sf9細胞中獲得的重組蛋白在前100 min的孵育中呈現(xiàn)良好穩(wěn)定的活性，其活性明顯高于用v79，CHL細胞系獲得的人UGT1A9和UGT1A3.2重組蛋白，且滿足本實驗檢測條件的靈敏度要求，該方法產(chǎn)生的代謝酶可以用于后續(xù)實驗的定量研究。 二．UGT1A3和UGT1A9對槲皮素的區(qū)域選擇性研究槲皮素，這一廣泛分

10、布的飲食類黃酮，在體內(nèi)幾乎只能檢測到其代謝物，故其行使藥理活性，至少部分通過代謝物進行。葡萄糖醛酸結(jié)合是槲皮素吸收后的主要結(jié)合途徑，不同的槲皮素葡萄糖醛酸苷具有顯著不同的藥理活性。因此，UGT酶對槲皮素各個羥基的區(qū)域選擇性可能決定了該酶對槲皮素藥理活性的貢獻。 在本實驗中，從Bac-to-Bacr表達系統(tǒng)中獲得的UGT13A3和UGT1A9被用于催化槲皮素的葡萄糖醛酸結(jié)合反應，它們對于槲皮素各羥基的區(qū)域選擇性通過各個羥基的動力學

11、參數(shù)計算定量評估。Lc一．MS實驗結(jié)果表明，兩個酶都催化槲皮素生成4個槲皮素單葡萄糖醛酸苷。經(jīng)HPLC分離后，我們收集了每個單葡萄糖醛酸苷，并利用黃酮的uV光譜確定了每個苷的結(jié)構(gòu)，它們分別是槲皮素7-，3-，4-和3-葡萄糖醛酸苷。每個單葡萄糖醛酸苷的酶動力學參數(shù)被確定，并用于定量分析UGTA13和UGT1A9對槲皮素的區(qū)域選擇性。UGT1A3最偏好生成3-葡萄糖醛酸苷，然后是3-，4r-和7-葡萄糖醛酸苷?？紤]到槲皮素-3’-葡萄糖醛

12、酸苷的低抗氧生理活性以及UGT1A3本身較弱的槲皮素總催化活性，表明UGT1A3在槲皮素的藥理活性中只扮演一個有限的角色。而對UGT1A9來說，催化效率的順序是3->7->3->4’-葡萄糖醛酸苷，槲皮素-7-葡萄糖醛酸苷的高抗氧活性和以及UGT1A9較強的槲皮素總催化活性，表明UGT1A9對于槲皮素的生理活性十分重要。 三．UGT1A3和UGT1A9對黃酮類的代謝研究黃酮是最常見和廣泛分布的一類多酚化合物，黃酮的很多健康有益特

13、性已經(jīng)通過體外實驗被報道。如果不了解黃酮的體內(nèi)生物利用度、與胃腸道的相互作用、結(jié)合、代謝等情況，就無法由體外實驗預測其體內(nèi)的抗氧化活性。 葡萄糖醛酸結(jié)合是黃酮吸收后三條主要的結(jié)合途徑之一。本文中，重組UGT1A3和UGT1A9被用于19個黃酮底物的結(jié)合研究，其中的11個化合物能夠被UGT1A3或者UGT1A9代謝。異鼠李素，桑色素，水飛薊，山萘酚，黃豆苷元，槲皮素-3’，4’-OCHO-，槲皮素吡喃木糖苷和扁蓄苷是本文首次報道的

14、UGT1A3底物.-而菜素，桑色素，黃豆苷元，槲皮素-3’，4-OCHO-，槲皮素吡喃木糖苷和扁蓄苷也是從未報道的uGT1A9底物。一個黃酮底物通常產(chǎn)生多個葡萄糖醛酸苷，但豐度并不相同，表明UGTs酶對黃酮的多個羥基存在區(qū)域選擇性催化。LC-MS分析表明，這兩種酶都只能催化形成黃酮的單葡萄糖醛酸苷，而不能形成雙葡萄糖醛酸苷。動力學分析顯示，人類的UGT1A3和UGT1A9更傾向于催化黃酮的苷元而不是糖苷，它們對大部分黃酮苷元，尤其是黃酮

15、醇，都有較高的催化活性，但是這種催化效率(Vmax/km)隨黃酮苷元的結(jié)構(gòu)改變而改變。UGT1A9的總體催化效率要高于UGT1A3，表明它在黃酮類葡萄糖醛酸結(jié)合反應中的重要作用。 四．UGT1A3變異體的功能及在中國人群中的分布UGTs基因呈高度多態(tài)性。與細胞色素P450酶系相似，UGTs的遺傳變異也可能導致不同的表型，引起藥物效率和外源物毒性差異。在本實驗中，野生型和變異的人類UGT1A3酶被表達于Bac-to-Bacr桿狀病

16、毒表達系統(tǒng)中。我們使用6種廣泛分布的黃酮，槲皮素，木犀草素，山萘酚，水飛薊，桑色素和異鼠李素，作為底物，來檢測UGTlA3變異體對黃酮葡萄糖醛酸結(jié)合活性的差異。UGT1A3.4對所有測試黃酮的活性都有顯著增加，催化效率(Vmax/km)是野生型UGT1A3.1的3.6～7.8倍。而UGT1 A3.2和UGT1A3.3則導致葡萄糖醛酸結(jié)合活性顯著下降，它們對于大部分測試黃酮的活性甚至低于野生型的20％。UGT11A3.5只引起微弱的活性差

17、異。此外，所有變異體對于槲皮素底物的區(qū)域選擇性變化也被進行了研究。UGT1A3.2，UGT1A3.4和UGT1A3.5對高活性的槲皮素7-和3-葡萄糖醛酸苷的偏好遠大于野生型，可能使人體對黃酮的反應發(fā)生變化。UGT1A3 45位，47位氨基酸及其附近區(qū)域可能是其活性相關(guān)的重要位點。 本實驗也首次確定了UGT1A3各等位基因和幾個UGT1A3SNPs在中國漢族人群中的分布。部分UGT1A3等位基因和UGT1A3的SNPs在中國漢族