調控DLC-1和FAK對卵巢癌細胞OVCAR-3的影響.pdf

1、研究表明,卵巢惡性腫瘤占女性生殖道惡性腫瘤的22.9％,近年來卵巢癌的發(fā)病率呈上升的趨勢,40年來增加了3倍。在婦女生殖道癌中,卵巢癌是造成死亡原因最高的,也是對女性生命及健康威脅最大的一種疾病。雖然卵巢癌手術和化學療法有了長足的進展,但其預后仍差,尤其是晚期患者的5年生存率仍無明顯改善。尋找治療卵巢癌的新方法仍是一任重而道遠的任務。
　　 肝癌缺失基因1(deleted in liver cancer-1,DLC-1)是近期國

2、內外學者們發(fā)現(xiàn)的重要抑癌基因之一,DLC-1在人類多種組織中均有表達,而在多種腫瘤組織中通常呈低表達或不表達。FAK即粘著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK),是一種酪氨酸激酶,在粘著斑上被激活,在人類多種腫瘤中FAK的表達增加或發(fā)生磷酸化,這種變化可導致侵襲性腫瘤細胞的表達和轉移機會增加,從而促進腫瘤的發(fā)生和轉移。
　　 FAK和DLC-1在卵巢癌研究中的新發(fā)現(xiàn)和在腫瘤中所起的重要作用,使其作為卵巢腫瘤

3、的兩個有潛在價值的候選基因成為可能,期望二者可用于卵巢癌的早期診斷、預后判斷等,有望成為卵巢癌治療的新靶點。國外學者Tai Young Kim等的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在肝癌細胞中DLC-1表達可引起FAK的去磷酸化,能導致FAK的失活,阻止黏著斑的形成,降低腫瘤細胞的黏附性,使腫瘤細胞凋亡,起到抑制腫瘤發(fā)生的作用。故我們的前期實驗研究選擇了FAK和DLC-1為研究對象,研究它們在卵巢癌中的發(fā)病機制,實驗中我們研究了單獨表達DLC-1基因對卵巢癌

4、OVCAR-3細胞的影響,其中包括DLC-1對FAK、JAN等的影響,關于DLC-1、FAK基因雙重作用對卵巢癌影響的研究尚未見報道。
　　 目前常用的一種新的腫瘤基因治療方法是基因轉染技術,該方法能夠在基因水平上糾正異常細胞的遺傳缺陷,從最根本上改變癌細胞的遺傳性。RNA干擾技術(RNAintering,siRNA或RNAi)是近期發(fā)現(xiàn)的一種高效而又特異性強的基FAK對OVCAR-3細胞凋亡的影響o
　　 4.應用We

5、stern-blotting方法觀察干預DLC-1、FAK對ERK、pERK蛋白表達及ERK磷酸化水平的影響。
　　 5.通過體內裸鼠移植瘤實驗測定干預DLC-1、FAK表達對OVCAR-3移植瘤形成和生長的影響。
　　 統(tǒng)計學方法
　　 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析處理所有實驗數(shù)據(jù),計量資料用-x±s表示,結果采用t檢驗、u檢驗和單因素方差(One-wayANOVA)分析;采用X2檢驗和校正X2檢驗進行

6、統(tǒng)計學處理計數(shù)資料;Spearman等級相關分析相關性資料,α=0.05作為檢驗水準。
　　 結果
　　 第一部分
　　 1.通過免疫組化方法發(fā)現(xiàn)DLC-1蛋白在正常卵巢組織中的陽性表達率明顯高于卵巢上皮癌組織;p-FAK蛋白在卵巢上皮癌組織的陽性表達率明顯高于正常卵巢組織中,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。
　　 2.DLC-1蛋白在有腹水、淋巴結轉移和手術-病理分期晚的卵巢上皮性癌患者中低表達或表

7、達缺失,p-FAK蛋白在有腹水、淋巴結轉移和組織學分級高的卵巢上皮性癌患者中高表達。
　　 3.DLC-1陽性患者的5年生存率明顯高于p-FAK陽性的患者(p=0.009)。
　　 第二部分
　　 1.構建出FAK基因的siRNA載體重組子、DLC-1基因表達載體重組子、對FAK基因和DLC-1基因共同作用的載體重組子。
　　 2.得到沉默F(xiàn)AK基因的OVCAR-3轉染細胞、表達DLC-1基因的OVCAR

8、-3轉染細胞和沉默F(xiàn)AK同時表達DLC-1的OVCAR-3轉染細胞。
　　 第三部分
　　 1.調控后的DLC-1和FAK對OVCAR-3細胞增殖、黏附的影響
　　 1.1 FCM實驗結果:沉默F(xiàn)AK基因或/和增加DLC-1基因表達均可減少S期和G2/M期細胞比例,增加G0/G1期細胞比例,且表達DLC-1同時沉默F(xiàn)AK表達(雙作用組)的效果更顯著,與單獨沉默F(xiàn)AK基因或單一增加DLC-1基因組相比,差異具有顯著

9、性(p＜0.01)。
　　 1.2 CCK-8試劑繪制細胞生長曲線結果:沉默卵巢癌OVCAR-3細胞FAK基因或/和增加DLC-1基因表達,可以降低卵巢癌OVCAR-3細胞的生長速度,雙作用組抑制效果更佳,與單獨增加DLC-1基因組相比,差異具有顯著性(p＜0.01),但與單一沉默F(xiàn)AK基因組相比,差異無顯著性(p＞0.05)。
　　 1.3細胞基質黏附實驗結果:單一高表達DLC-1基因,對OVCAR-3細胞與基質膠黏著

10、、纖維粘連蛋白黏著的吸光度值的影響不大;高表達DLC-1基因同時沉默F(xiàn)AK基因表達組、單一沉默F(xiàn)AK表達組均可降低卵巢癌OVCAR-3細胞與基質膠黏著、纖維粘連蛋白黏著的吸光度值,與單獨沉默F(xiàn)AK組相比,雙作用組的效果更顯著(p＜0.001)。
　　 2.調控后的FAK和DLC-1對OVCAR-3細胞的侵襲能力影響
　　 2.1通過Transwell實驗觀察細胞體外侵襲能力,結果顯示:增加DLC-1基因表達或/和沉默F(xiàn)A

11、K基因表達均可顯著降低OVCAR-3細胞穿透Matrigel能力,且雙作用組的效果更顯著,與單一沉默F(xiàn)AK基因或單一增加DLC-1基因組相比,差異具有顯著性(p＜0.05)。
　　 2.2用RT-PCR方法檢測MMP-2、MMP-9、TMP1 mRNA表達水平,得到如下結果:
　　 單一高表達DLC-1基因,對MMP-2和TIMP1 mRNA相對表達量作用不明顯,表達DLC-1同時沉默F(xiàn)AK表達和單一沉默F(xiàn)AK表達,均可

12、顯著降低OVCAR-3細胞MMP-2 mRNA相對表達量、增加TIMP1 mRNA相對表達量,雙作用組的效果更顯著,與單一沉默F(xiàn)AK表達組相比,差異具有顯著性(p＜0.05)。
　　 表達DLC-1和/或沉默F(xiàn)AK表達均可顯著降低OVCAR-3細胞MMP-9mRNA相對表達量,雙作用組的效果更顯著,與單一沉默F(xiàn)AK基因或單一增加DLC-1基因組相比,差異具有顯著性(p＜0.05)。
　　 3.調控后的DLC-1和FAK對

13、OVCAR-3細胞凋亡的影響
　　 3.1 FCM檢測細胞凋亡結果:在卵巢癌OVCAR-3細胞中沉默F(xiàn)AK基因表達或/和增加DLC-1基因表達,可以提高卵巢癌OVCAR-3細胞凋亡率,促使其發(fā)生凋亡,其中以雙作用的促凋亡效果更佳,與單一沉默F(xiàn)AK基因組或單一增加DLC-1基因組相比,G2/M期細胞比例明顯減少,差異具有顯著性(p＜0.01)。
　　 3.2通過ELISA測定細胞Caspase-3、9的活性發(fā)現(xiàn):在卵巢癌O

14、VCAR-3細胞中沉默F(xiàn)AK基因表達或/和增加DLC-1基因表達,可以提高卵巢癌OVCAR-3細胞中Caspase-3和Caspase-9蛋白酶活性,其中以雙作用組的作用最強,與單一沉默F(xiàn)AK基因組或單一增加DLC-1基因表達組相比,差異具有顯著性(p＜0.05)。
　　 4.調控后的FAK和DLC-1對OVCAR-3細胞中ERK蛋白、pERK蛋白及其磷酸化水平的影響
　　 應用western-blot方法檢測發(fā)現(xiàn):表達

15、DLC-1基因或/和沉默F(xiàn)AK基因表達均可降低OVCAR-3細胞中ERK、pERK蛋白,雙作用組的效果最強(p＜0.05);單獨高表達DLC-1基因,對ERK磷酸化水平無明顯影響,雙作用組、沉默F(xiàn)AK組均可降低OVCAR-3細胞中ERK磷酸化水平,與沉默F(xiàn)AK組相比,雙作用組的作用更強(p＜0.05)。
　　 5.調控后的DLC-1和FAK對裸鼠移植瘤實驗的影響
　　 在卵巢癌OVCAR-3細胞中沉默F(xiàn)AK基因或/和增加

16、DLC-1基因表達,(1)可以減小裸鼠腫瘤的體積,其中以雙作用組的抑制作用最強,與單一沉默F(xiàn)AK基因組或單一表達DLC-1基因組相比,差異具有顯著性(p＜0.001);)(2)可以減小裸鼠腫瘤的重量,其中以雙作用組的抑制作用最強,與單一沉默F(xiàn)AK基因組或單一表達DLC-1基因組相比,差異具有顯著性(p＜0.002)。
　　 結論
　　 第一部分
　　 1.DLC-1蛋白在卵巢上皮癌組織中低表達或不表達缺失,在卵巢

17、上皮性癌組織中p-FAK蛋白強表達,提示二者有可能可作為卵巢上皮性癌的早期診斷指標。
　　 2.DLC-1蛋白的陽性表達與卵巢癌的腹水形成、淋巴結轉移和手術-病理分期有關,與卵巢癌的組織學分級無關;p-FAK蛋白的陽性表達與卵巢癌的腹水形成、淋巴結轉移和組織學分級密切相關,與卵巢癌的手術.病理分期無關。說明二者與卵巢癌的發(fā)生、轉移、浸潤有關。
　　 3.DLC-1陽性患者的5年生存率明顯高于p-FAK陽性的患者,提示二者

18、與卵巢癌患者預后有關。
　　 第二部分
　　 構建出針對FAK基因的三個siRNA重組載體,篩選得到有效沉默F(xiàn)AK基因的OVCAR-3細胞株、高表達DLC-1基因的OVCAR-3細胞株及高表達DLC-1基因同時沉默F(xiàn)AK基因表達的雙作用OVCAR-3細胞株。
　　 第三部分
　　 通過體外實驗證明在卵巢癌細胞內單一高效表達DLC-1基因或/和單一沉默F(xiàn)AK.基因表達,可抑制卵巢癌細胞OVCAR-3的增殖、

19、降低侵襲能力、促進其調亡,并降低ERK的磷酸化水平,提示高表達DLC-1或/和沉默F(xiàn)AK表達,可減少腫瘤的發(fā)生和轉移。雖然單一高效表達DLC-1基因對OVCAR-3細胞黏附能力、OVCAR-3中MMP-2、TIMP1 mRNA相對表達量及ERK磷酸化水平無明顯影響,但與沉默F(xiàn)AK基因聯(lián)合后,均可起到顯著作用,且雙作用組效果優(yōu)于單一沉默F(xiàn)AK基因組。
　　 通過體內實驗證實在卵巢癌細胞內高表達DLC-1、沉默F(xiàn)AK,可有效抑制卵巢