乙型肝炎病毒X蛋白促p16INK4A基因啟動子甲基化及其機制的研究.pdf

1、肝細胞性肝癌(HCC)是威脅全世界人民尤其是中國人民身體健康的最常見的惡性腫瘤之一。研究發(fā)現(xiàn),HCC的發(fā)生與黃曲霉素B1的污染、酒精性肝硬化、某些遺傳性肝臟疾病、特別是乙型或丙型肝炎病毒(HBV或HCV)的感染密切相關。HBV感染的人群中,HCC的發(fā)生率比普通人群高200倍至300倍左右,我國HCC病人HBV標志物陽性率更高達90％左右。HCC的發(fā)生是一個多因子、多步驟的過程,但其具體機制仍不清楚。
　　有研究表明,抑癌基因如GS

2、TP、SOCS-1、APC、E-cadherin、RAR-β、p14、p15、p16和p73啟動子區(qū)高甲基化普遍存在于肝癌和其它人類惡性腫瘤中。HBV的感染能增加抑癌基因啟動子區(qū)的甲基化而使其表達下調,該機制可能是HBV相關HCC中病毒致癌的一個重要途徑。HCC中普遍存在p16INK4A啟動子區(qū)的高甲基化,而且HBV感染能顯著增加肝組織p16INK4A啟動子區(qū)的甲基化頻率,從而使p16蛋白低表達或不表達,在HCC形成早期起了重要作用。本

3、課題組前期研究結果提示,在組織學水平,HBV的X蛋白(HBx)與p16INK4A啟動子區(qū)高甲基化相關,但其中的機制尚不清楚。
　　本研究一方面選取了大量HBV相關HCC部分肝切除標本作為研究對象,同時輔以部分HBV陰性標本作為對照。通過對HCC的癌組織和相應的癌旁組織在mRNA水平和蛋白水平進行檢測,對組織水平HBx與p16INK4A的啟動子高甲基化相關性進行進一步確認,明確HBx與DNA甲基轉移酶(DNMTs)和去甲基化酶的表達

4、是否相關,DNMTs和去甲基化酶的表達是否與p161NK4A啟動子區(qū)高甲基化相關。另一方面在體外細胞水平通過穩(wěn)定轉染pcDNA3.1-HBx質粒至肝癌細胞研究HBx促進p16INK4A啟動子高甲基化的機制,明確DNA甲基轉移酶DNMT1,DNMT3A,DNMT3B和去甲基化酶MBD2在HBx促進p16INK4A啟動子高甲基化過程中各自的作用,為HBV相關HCC的形成機制提供新的研究方向。
　　第一部分：乙型肝炎病毒X蛋白與p16I

5、NK4A啟動子甲基化及甲基轉移酶的相關性的體內研究
　　目的:通過對HBV相關HCC的癌組織和相應的癌旁組織標本中HBx與p16INK4A啟動子高甲基化及甲基轉移酶的相關性研究,明確HBx與p16INK4A啟動子甲基化和DNMTs以及去甲基化酶的表達是否相關。
　　方法:收集88例HBV相關HCC部分肝切除標本癌組織和癌旁組織進行分析,并收集部分HBV陰性標本作為對照。p16INK4A啟動子甲基化狀態(tài)的檢測采用甲基化特異性聚

6、合酶鏈反應(MSP);熒光實時定量PCR檢測HBx,DNMT1,DNMT3A,DNMT3B,去甲基化酶MBD2的表達和肝組織內HBVDNA的含量;HBV基因型采用巢式PCR和限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)進行檢測;Westernblot和免疫組化EnVision二步法檢測組織HBx,DNMT1,DNMT3A和p16蛋白的表達。
　　結果:在HBV相關HCC病例的癌旁組織中,HBx的高表達與p16INK4A啟動子高甲基化相關;無論

7、是在mRNA水平還是蛋白水平,HBx的表達與DNMT1和DNMT3A的表達均呈正相關;而且HBx,DNMT1和DNMT3A的表達與p16蛋白的表達均呈負相關。在HBV相關HCC病例的癌組織中,HBx的表達與DNMT1和DNMT3A的表達在mRNA水平和蛋白水平均呈正相關;但HBx的高表達與p16INK4A啟動子高甲基化和p16蛋白的表達均不相關。p16INK4A啟動子甲基化狀態(tài)與患者年齡,性別,血清中AFP,CEA,CA199水平無關,

8、與血清AST,ALT水平,病毒基因型,HBV-DNA水平,腫瘤分化程度,癌旁組織Scheuer評分也無相關性。
　　結論:p16INK4A啟動子甲基化在肝癌中普遍存在,其表達量與HBx蛋白呈負相關。在HBV相關HCC形成的早期階段,HBx可能通過上調甲基轉移酶DNMT1和DNMT3A促進p16INK4A啟動子甲基化從而使其表達下降,在HBV相關HCC的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。
　　第二部分：乙型肝炎病毒X蛋白促p16IN4

9、A啟動子甲基化及其機制的體外研究
　　目的:HBx可通過促進某些抑癌基因啟動子甲基化下調抑癌基因的表達,但其具體機制卻不清楚。本研究旨在細胞水平明確HBx促進p16IN4A啟動子甲基化過程中甲基轉移酶和去甲基化酶各自的作用,明確HBx介導的表觀遺傳修飾的可能機制。
　　方法:將含有HBx基因的質粒pcDNA3.1(pcDNA3.1-HBx質粒)穩(wěn)定轉染L02細胞,HepG2細胞和BEL-7404細胞;各組細胞中p16IN4A

10、啟動子甲基化狀態(tài)的檢測采用亞硫酸氫鹽測序法;熒光實時定量PCR檢測HBx,DNMT1,DNMT3A,DNMT3B和去甲基化酶MBD2的表達;Western blot檢測HBx,DNMT1,DNMT3A和p16蛋白的表達。
　　結果:在mRNA水平和蛋白水平,HBx均可上調DNMT1和DNMT3A的表達:HBx可通過上調DNMT1和DNMT3A的表達從而促進p16IN4A啟動子甲基化;HBx可通過促進p16IN4A啟動子甲基化從而下