三氟乙醇和Zn2+對α-葡萄糖苷酶活力與結構的影響.pdf

1、目的和意義:環(huán)境污染伴隨著工農業(yè)生產的發(fā)展而出現。研究表明，糖尿病發(fā)生除了觀察到胰島素分泌不足或胰島素拮抗直接導致的作用外，由遺傳、環(huán)境、行為等因素的共同作用也不容忽視。α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20)為世人所認識的是其與臨床2型糖尿病有關，而這種酶的抑制劑則與2型糖尿病的治療相關。而口服抗糖尿病藥物，通過抑制α-葡萄糖苷酶的作用而影響碳水化合物的吸收，對糖尿病治療起著關鍵調節(jié)的作用。開展對α-葡萄糖苷酶抑制劑的研究，不僅具有生物

2、與醫(yī)療方面的價值，也與環(huán)境污染的相關研究有著密切的聯系。
　　 α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20)水解α-葡萄糖苷酶非還原端末端1-4α-連接的D-葡萄糖的殘基，最后一步是消化碳水化合物，α-葡萄糖苷酶活性與血糖水平直接相關。由于它在二型糖尿病患者葡萄糖的吸收中具有潛在的下調作用，因而具有重要的臨床意義。有幾種類型的α-葡萄糖苷酶抑制劑被報道過，包括基質類似物，生物堿類，酚類物質，姜黃素類化合物和天然原料中的花青素。這些抑制

3、劑治療通常是用來口服的。它的通過抑制α-葡萄糖苷酶活性進而阻止碳水化合物的消化吸收和糖類的生成。工業(yè)上，α-葡萄糖苷酶常用來將淀粉轉換成發(fā)酵糖，這是酒精生產的重要步驟.這種酶還可以水解各種各樣的吡喃葡萄糖苷，例如蔗糖，海藻糖和麥芽糖。然而，對這種酶折疊過程中的構象和活性變化研究不多。因此，對該酶結構和功能的研究具有重要意義。
　　 三氟乙醇（簡稱TFE）的變性實驗有助于理解酶的催化作用，穩(wěn)定性，包括維持酶二級和三級結構的作用力、

4、構象的柔性、緊密性和折疊途徑。因此TFE常被用做研究酶結構特征的變性劑，而且TFE對酶活性和蛋白質穩(wěn)定性的影響已經得到了很好的證明。已經做了對酶活性和結構在有機溶劑中的變化的廣泛的研究。TFE在蛋白質折疊研究中常被用來做潛溶劑，因為它能夠在濃度較低的時侯通過破壞疏水結構從而使蛋白質的三級和四級結構不穩(wěn)定，TFE也常被用來鑒定與蛋白質聚集相關的疾病。
　　 Zn2+是很多酶的輔助因子，也充當轉錄因子角色和突觸傳遞中的底物。Zn>是

5、有助于機體正常生長和發(fā)育，增強免疫功能，促進傷口愈合。因此Zn2+是機體的一個必要成分，在新陳代謝和疾病中起著重要的作用。由于Zn2+在細胞功能方面的重要性，維持身體健康要求飲食中含有足夠多的Zn2+。但是，有研究表明在特定條件下Zn2+會直接抑制酶的功能，α-葡萄糖苷酶和Zn2+的關系還不是很清楚，先前基于精漿內含物的研究顯示α-葡萄糖苷酶和Zn2+可能在人類生殖方面起重要作用，但是α-葡萄糖苷酶和Zn2+的直接關系還沒有發(fā)現。

6、>　　 在TFE和Zn2+存在的情況下進行了對α-葡萄糖苷酶的動力學分析更進一步了解其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用。通過用TFE和Zn2+結合計算機模擬進行了α-葡萄糖苷酶動力學研究，來觀察任何誘導α-葡萄糖苷酶結構的改變。TFE和Zn2+誘導α-葡萄糖苷酶的失活研究為這種酶的抑制作用提供了新的認知，同時暗示了TFE和Zn2+可能具有的臨床應用。
　　 研究方法:
　　 1)測量不同濃度TFE對α-葡萄糖苷酶的活性影響并

7、記錄數值。
　　 2)保持底物濃度不變，改變TFE和α-葡萄糖苷酶的濃度，同樣測定其活性，并作圖對比判斷抑制類型。
　　 3)改變TFE和底物的濃度，保持酶的濃度不變，測定數據作雙倒數圖，判斷抑制動力學參數。
　　 4)使用不同高濃度的TFE，固定底物濃度和酶濃度，按照作用時間不同測定活性，繪制酶活性的抑制變化時間過程圖。
　　 5)通過內源熒光和ANS結合熒光光譜學分析方法分析其三級結構特征。
　

8、　 6)最后使用計算機模擬同源建模的方式，預測α-葡萄糖苷酶3D結構及其與TFE的結合位點。
　　 7)測定不同濃度Zn2+對α-葡萄糖苷酶的活性影響，并記錄數值。
　　 8)保持底物濃度不變的情況下，改變Zn2+和α-葡萄糖苷酶的濃度，同樣測定其活性，并作圖對比判斷抑制類型。
　　 9)使用不同濃度的Zn2+，固定底物濃度和酶濃度，按照作用時間不同測定活性，繪制酶活性的抑制變化時間過程圖。
　　 10

9、)改變Zn2+和底物的濃度，保持酶的濃度不變，測定數據作雙倒數圖，判斷抑制動力學參數。
　　 11)最后使用計算機模擬的方式，預測α-葡萄糖苷酶與Zn2+的結合位點。
　　 結果:
　　 1) TFE對α-葡萄糖苷酶的結構和功能影響研究:TFE濃度低的時候（低于2％）α-葡萄糖苷酶活性有輕微的激活，之后隨著TFE濃度的增加其活性喪失呈現劑量依賴性。半抑制劑濃度IC50大約是7+0.2％(0.97+0.028M)。

10、TFE濃度低于2％時酶活性與天然酶活性相比增加20％。當TFE濃度增加到12％時，酶的活性完全喪失。使酶活性完全喪失需要相當高的濃度，這很可能跟TFE的溫和親電子性有關。通過不同濃度的酶和不同濃度的TFE做剩余活性曲線判斷TFE對酶作用的可逆性。結果中可以看出，所有的直線都經過原點，表明TFE對酶的作用是可逆的。
　　 通過時間間隔實驗測量出速率常數并估算失活動力學常數。TFE對葡萄糖苷酶活性的減少屬于時間依賴性的一級反應。當T

11、FE濃度低于2％時，酶的活性不但不會喪失反而會激活了20％。當TFE活性高于6％時，活性以兩種途徑喪失:一部分在非常短的時間內喪失（不超過30秒）以至于不能夠測量出來，余下部分以一級動力學反應過程逐漸失活。
　　 通過內源熒光光譜測量TFE對α-葡萄糖苷酶結構的影響。觀察到了TFE與α-葡萄糖苷酶的結合直接誘導α-葡萄糖苷酶構象變化:TFE濃度低于2％時，熒光光譜沒有變化，但是當濃度超過3％時，熒光光譜發(fā)生了顯著的改變，TFE濃

12、度為50％時，最大峰位置的紅移達到最高值，這表明TFE和α-葡萄糖苷酶的結合達到飽和狀態(tài)。我們用ANS結合熒光來觀察TFE誘導α-葡萄糖苷酶疏水性表面的變化。結果顯示，隨著熒光強度的增加，TFE誘導α-葡萄糖苷酶的疏水表面逐漸暴露出來。綜上所述，內源和ANS-熒光探針都直接反映出TFE誘導α-葡萄糖苷酶發(fā)生了去折疊現象。
　　 利用HHsearch和T-Coffee方法從十個模板結構中找出序列對比。用PQR-SA開發(fā)出了α-葡萄

13、糖苷酶的同源結構。TFE對α-葡萄糖苷酶誘導失活的模擬對接顯示:ASP68，TYR71，VAL108，HIS111，PHE177，ASP214，THR215，GLU276，HIS348，ASP349和ARG439等氨基酸殘基與TEE發(fā)生了相互作用，分子動力學模擬證實了TFE誘導α-葡萄糖苷酶失活時的結合機制和結合位點。通過10毫秒分子動力學模擬，模擬結果顯示TFE貫穿到了酶的核心，停留在與葡萄糖基團結合的氨基酸殘基上，這表明TFE可能是

14、一種抑制劑，能抑制α-葡萄糖苷酶的活性。
　　 2) Zn2+對α-葡萄糖苷酶的結構和功能影響研究:在Zn2+濃度為0.3 mM時，酶的活性完全喪失，半抑制劑濃度IC50大約是0.056±0.006 mM，α-葡萄糖苷酶活性的喪失需要相當高濃度Zn2+。Zn2+對α-葡萄糖苷酶活性抑制的可逆性結果顯示所有直線都通過原點，表明Zn2+抑制酶的活性反應是是可逆的。二次作圖可以看出Zn2+對α-葡萄糖苷酶的抑制機制并不是簡單的直線混合

15、型抑制而是拋物線混合型抑制。利用半對數圖標繪的動力學分析顯示單相和雙相失活包含快相和慢相兩個過程，隨著Zn2+濃度的增加單相發(fā)展成兩相進程，所有進程都是一級動力學。
　　 觀測到Zn2+結合α-葡萄糖苷酶直接誘導三級結構改變。隨著劑量的加大，熒光光譜強度明顯減少，最大峰值發(fā)生明顯的紅移。當Zn2+濃度為50 mM時，離子濃度趨于飽和狀態(tài)紅移達到最大峰值。通過ANS結合熒光光譜的測量發(fā)現由于Zn2+的結合，使α-葡萄糖苷酶的疏水表

16、面得到輕微的暴露。
　　 同時對Zn2+和α-葡萄糖苷酶進行了10毫微秒的分子動力學模擬。模擬顯示10個鋅離子可能和57個α-葡萄糖苷酶殘基發(fā)生相互作用。分子動力學模擬也證明了Zn2+對α-葡萄糖苷酶的結合機制，顯示Zn2+結合位點并不是落在α-葡萄糖苷酶的葡糖糖結合口袋。
　　 結論:
　　 1) TFE和Zn2+可以導致α-葡萄糖苷酶的變性。
　　 2) TFE和Zn2+誘導的α-葡萄糖苷酶結構變化中

17、，活性位點的穩(wěn)定性比其他部分結構的穩(wěn)定性更高。
　　 3)低濃度TFE和Zn2+誘導了整體結構的變化，但活性位點仍然保持完整。
　　 4) TFE和Zn2+不直接與底物競爭，但會改變α-葡萄糖苷酶三級結構。
　　 5) TFE和Zn2+與α-葡萄糖苷酶配體結合導致了酶活性的混合型抑制。
　　 6)α-葡萄糖苷酶三級結構改變的原因是疏水表面的暴露。
　　 7)計算機模擬TFE和Zn2+與α-葡萄糖苷