TGF-β1誘導的上皮—間質轉化在人膀胱尿路上皮癌中的研究.pdf

1、第一部分構建經TGF—β1誘導的EMT化的膀胱尿路上皮細胞癌T24細胞并驗證
　　目的：探索利用TGF—β1因子提高人膀胱尿路上皮癌T24細胞系EMT水平的最佳誘導濃度和誘導時間，并進行基因表達、生物學行為等的驗證。
　　方法：培養(yǎng)人膀胱尿路上皮癌T24細胞系并傳代，使用不同濃度的TGF—β1因子進行誘導，然后在不同時間點對細胞形態(tài)變化進行觀察。利用實時熒光定量PCR技術對上皮細胞—間質轉化的標志物（如:Vimentin、M

2、MP2、E—cadherin、slug、 ZEB1等等）的表達水平進行檢測。利用細胞劃痕試驗、Transwell小室遷移試驗等對誘導前后細胞的侵襲、穿透、遷移等能力進行了檢測和評估，進一步驗證TGF—β1因子的最佳誘導濃度和誘導時間。
　　結果：濃度為10ng/ml的TGF—β1誘導T24細胞36h后，T24細胞的細胞形態(tài)提示有上皮細胞間質化的發(fā)生;同時，EMT標志性基因的表達水平亦出現(xiàn)相應改變，如:間質細胞標志物Vimentin

3、和MMP2表達水平上調，E—cadherin等上皮細胞標志物表達下調，slug、ZEB1等促EMT因子表達上調;另外，細胞劃痕試驗顯示，10ng/ml的TGF—β1因子誘導前后兩組的平均愈合面積（百分比）差異有顯著性(0.81 vs1，P＜0.05);同樣，Transwell小室遷移試驗檢測T24—N.C.組和T24—TGF—β1組細胞的侵襲情況發(fā)現(xiàn)10ng/ml T24—TGF—β1組細胞侵襲能力明顯增強，(每視野平均細胞數(shù)54.6

4、vs97.65，P＜0.05)。
　　結論：膀胱尿路上皮癌T24細胞經濃度為10ng/ml的TGF—β1因子誘導36小時后其細胞形態(tài)學出現(xiàn)較為明顯的上皮細胞間質化改變。并且，其誘導后細胞的基因呈現(xiàn)EMT化的相關表達，其細胞的侵襲、穿透、遠處轉移的能力有著明顯的增強。
　　第二部分 TGF—β1誘導的EMT化的膀胱尿路上皮癌T24細胞的mRNA和microRNA的表達譜
　　目的：獲得TGF—β1因子誘導的膀胱尿路上皮癌

5、T24細胞的microRNA表達譜和mRNA的表達譜。
　　方法：對TGF—β1誘導的EMT化的膀胱尿路上皮癌T24細胞的總RNA進行提取，并予以質檢。質檢合格后進行RNA純化、孵育加尾、標記生物素熒光、芯片雜交、清洗染色、掃描芯片、數(shù)據(jù)提取以及數(shù)據(jù)標準化等，所用芯片為目前較為先進GeneChip(R)PrimeViewTMHuman Gene Expression Array芯片以及Multispecies miRNA2.0ar

6、ray芯片。然后注冊并利用分子功能注釋3.0系統(tǒng)(Capital Bio(R)Molecule Annotation System V3.0，MAS3.0)對芯片結果進行相關分析（如GO，KEGG pathway，靶基因預測，列聯(lián)分析等等）。
　　結果：經10ng/ml TGF—β1因子誘導36小時后的膀胱尿路上皮癌T24細胞共有包括SPC25等在內的1062個基因的表達下調，以及包括ASNS基因在內的572個基因的表達上調。經K

7、EGG pathway平臺分析發(fā)現(xiàn)，共有包括Cell cycle等在內的40條信號傳導通路與之密切相關。利用GO數(shù)據(jù)庫對該基因集進行闡釋，共運算出1250條相關的GO信息，其中多與細胞周期、細胞分裂、黏附、代謝調控、免疫反應、運動等密切相關。microRNA芯片掃描結果則顯示，miR—1184等在內的6個轉錄本表達下調，而以及包括miR—21等在內的8個microRNA的表達上調。MicroRNA芯片與mRNA芯片列聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)包括mic

8、roRNA—21、microRNA—146a以及microRNA—638在內的3個microRNAs與部分差異表達的基因的表達趨勢存在相關，其中包括ACVR1C、NOG、THBS1、TUBB2A等基因與EMT過程相關性較高。
　　結論：獲得了TGF—β1誘導的膀胱尿路上皮癌T24細胞系EMT過程中的mRNA以及microRNA差異表達譜;T24細胞系EMT過程中涉及到包括Cell cycle等在內的多個分子信號通路，這些分子信號通

9、路多與細胞的生長、連接、黏附、運動、侵襲等生物學行為相關;miRNA—21、miRNA—146a以及miRNA—638很可能通過靶向調控ACVR1C等基因的方式在T24細胞EMT過程中發(fā)揮作用。
　　第三部分對TGF—β1因子誘導的膀胱尿路上皮癌T24細胞的芯片篩選結果的驗證
　　目的：對生物信息學分析的基因芯片及microRNA芯片的結果進行初步的實驗室驗證，以期提高該結果的可信性。
　　方法：利用microRNA

10、mimics以及microRNA inhibitor進行microRNA的過表達和抑制表達。Real-time PCR試驗驗證三個microRNA的表達趨勢是否與芯片結果相同、mimics和inhibitor的表達效果、以及對靶基因表達的調節(jié)。劃痕試驗、Transwell小室遷移實驗驗證細胞是否發(fā)生相應的侵襲、遷移、轉移等生物學行為改變。
　　結果：PCR結果顯示，microRNA—21、microRNA—146a以及microR

11、NA—638等microRNAs的表達趨勢與芯片結果相同，microRNA的mimics和inhibitor達到預期效果，并且這些microRNAs的靶基因表達與生物信息學分析結果相同;劃痕試驗顯示除陰性對照組(N.C.)外的mimics組侵襲能力明顯增強，inhibitor組的侵襲能力有所減弱。Transwell小室遷移實驗提示除陰性對照組(N.C.)外的mimics組遷移轉移能力明顯增強，inhibitor組的遷移轉移能力有所減弱。