Survivin基因啟動子驅動Trail誘導肝癌細胞凋亡.pdf

1、肝癌是常見的惡性腫瘤之一，目前主要的治療方法以手術、介入、放療為主，而基因治療有可能成為肝癌治療的新手段。在腫瘤的基因治療研究中，關鍵問題在于提高目的基因的靶向性。利用在多數腫瘤中特異性表達的啟動子序列，驅動目的基因特異地在腫瘤細胞中表達，是解決腫瘤基因治療靶向性問題的一個有效途徑[1]。Survivin是IAP家族的新成員。Survivin組織分布的最大特點是具有明顯的細胞選擇性，其在胚胎及多種腫瘤細胞系中高表達[2]，但是不表達于終

2、末分化的正常組織[3]。因此，研究者認為survivin啟動子可用作腫瘤靶向治療的工具，啟動下游殺傷基因特異性表達于腫瘤細胞，從而避免損傷正常細胞。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（tumornecrosisfactorrelatedapoptosisinducingligand，TRAIL）又稱為Apo2L（ligand），是Wiley發(fā)現的TNF超家族成員[4]，Trail的最大特點是能夠誘導多種腫瘤細胞及轉化細胞凋亡而對大多數正常細胞

3、無影響，而這一選擇性殺傷特性也預示著Trail在腫瘤治療中有廣泛的應用前景[5]。本研究我們擬構建含有Survivin340啟動子及Trail全長cDNA的重組質粒。評價其在腫瘤細胞和正常細胞中誘導蛋白表達能力的差異以及誘導腫瘤細胞凋亡的情況。 目的： 克隆人TrailcDNA基因和Survivin基因啟動子，構建重組質粒pcDNA3.1/SurP/Trail，檢測Survivin基因啟動子在腫瘤細胞與正常細胞中誘導Tr

4、ail蛋白表達能力的差異，并進一步檢測重組質粒pcDNA3.1/SurP/Trail誘導肝癌細胞凋亡的情況。 材料和方法： 1、主要材料：肝癌細胞株HepG2細胞，小鼠胚胎正常成纖維細胞3T3細胞，真核表達質粒pcDNA3.1（-），pluc340質粒（含有survivin特異啟動子的pGL3載體），大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞。 2、方法： 2.1引物設計 根據Trail及Survivin340

5、啟動子基因序列，分別設計了2對引物。Trail基因上游引物：5'-TCCGCTCGAGCCTCACTGACTATAAAAGAATAGAG-3'包含了XhoⅠ酶切位點：下游引物：5'-CCCAAGCTTGGGTTAGCCAACTAAAAAGGCC-3'包含了HindⅢ酶切位點。用該對引物擴增的PCR產物預期目的片段長度為955bp。Survivin啟動子基因上游引物5'-GAAGATCTTCTCAAGTGATGCTCCTGCCTA-3'包

6、含了BglⅡ的酶切位點，下游引物5'-TCCGCTCGAGTGTAGAGATGCGGTGGTCCT-3'包含了XhoⅠ的酶切位點。用該對引物擴增的PCR產物預期目的片段長度為423bp。 2.2Trail基因真核表達質粒的構建 HepG2肝癌細胞（由本室常規(guī)培養(yǎng)保存）用含有100mL/L新生牛血清的RMPI1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。用Trizol（TaKaRa公司產品）提取總RNA，逆轉錄反應按試劑盒（fermentas公

7、司）說明操作制備cDNA。取2μlcDNA用上游引物和下游引物進行PCR反應。反應條件：預變性94℃15s，變性94℃30s，退火53℃30s，延伸68℃75s，32個循環(huán)，終末延伸68℃5min。所得目的片段用限制性核酸內切酶XhoⅠ和HindⅢ雙酶切后插入pcDNA3.1（-）的XhoⅠ和HindⅢ多克隆位點之間，所得質粒命名為pcDNA3.1/Trail，進行測序。 2.3含有Survivin340啟動子的重組質粒構建

8、 克隆Survivin340啟動子基因，以pluc340為模板（本實驗室保存），利用上下游引物進行PCR反應，擴增條件如下：預變性94℃15s，變性94℃30s，退火56.5℃30s，延伸68℃75s，30個循環(huán)，終末延伸68℃5min。對所得目的片段及之前構建好的重組載體pcDNA3.1/Trail分別用限制性內切酶BglⅡ和XhoⅠ雙酶切，將酶切后產物純化后用T4連接酶進行連接，所得質粒命名為pcDNA3.1/SurP/Trai

9、l，進行測序。 2.4脂質體的轉染 在轉染前一天，將HepG2細胞與3T3細胞兩組細胞分別轉至6孔培養(yǎng)板中，濃度為2×105個/ml。當細胞融合約80%，用Iipofectamine-LTX轉染試劑盒將已構建好的重組質粒pcDNA3.1/SurP/Trail導入HepG2及3T3細胞中。轉染72小時提取兩組細胞的總蛋白，用WesternBlot檢測兩組細胞Trail蛋白表達的差異。 2.5重組質粒的鑒定

10、用細胞裂解液RIPA和PMSF溶解細胞，12000xg離心30min去殘渣，BCA法蛋白定量，約50μg蛋白加入2xSDS上樣緩沖液96℃變性10min。12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，印跡轉染醋酸纖維膜。用含5%脫脂奶粉的TBST溶液在室溫下封閉2h以去除非特異結合部分，加入抗TRAIL抗體于4℃過夜。加入辣根過氧化酶標記的二抗室溫下孵育1h后，用WesternBlotChemiluminescence試劑盒檢測兩組細胞Trail蛋白的表達

11、。 2.6半定量RT-PCR檢測pcDNA3.1/SurP/Trail重組質粒轉染后TrailmRNA表達 將HepG2細胞分為3組細胞，培養(yǎng)子6孔板各一個孔中，第一組轉染pcDNA3.1/SurP/Trail重組質粒，定義為重組質粒組；第二組轉染pcDNA3.1（-）空白載體，定義為空白質粒組；第三組未轉染任何質粒，定義為未轉染組。轉染24小時后提取各孔細胞的總RNA，行半定量RT-PCR檢測各組不同處理的細胞中Tra

12、ilmRNA的表達情況。 2.7雙標記流式細胞術分析細胞凋亡 將HepG2細胞分為3組，分組同2.6項。轉染pcDNA3.1/SurP/Trail重組質粒48小時后收集各組細胞，參照AnnexinⅤ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒提供方法，處理細胞后用雙標記流式細胞術分析各組細胞的凋亡率。 2.8統(tǒng)計學分析 用SPSS13.0軟件進行分析，結果以mean±SD來表達，兩組比較采用獨立樣本t檢驗；三組比較采用單

13、向方差分析（One-wayANOVA），組間多重比較采用Bonferroni方法分析，并且當P<0.05時認為差異具有統(tǒng)計學意義。 結論： 本研究中通過分子克隆技術，成功克隆了TrailcDNA基因及Survivin啟動子基因，并成功構建重組質粒pcDNA3.1/SurP/Trail，通過Westernblot檢測到重組質粒在HepG2癌細胞中特異生物活性較在3T3正常細胞中強，能明顯誘導Trail蛋白的表達，誘導肝癌細