利用微生物生產(chǎn)膽固醇氧化酶的研究.pdf

1、膽固醇氧化酶是膽固醇代謝的關(guān)鍵酶之一，它催化膽固醇氧化及異構(gòu)化反應(yīng)，生成膽甾-4-烯-3-酮和過(guò)氧化氫。膽固醇氧化酶被廣泛應(yīng)用于臨床診斷、制藥工業(yè)、食品加工及生物農(nóng)藥等方面，具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　 本研究通過(guò)紫外+LiCl、紫外+光敏試劑處理類(lèi)芽孢桿菌X534，篩選出一株酶活較高的誘變菌株XUM10，酶活為221.20 U.L-1，比出發(fā)菌株提高了近2.5倍。
　　 此外對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行了改變，首先對(duì)突變株產(chǎn)酶條件進(jìn)行

2、了優(yōu)化，確定了合適的產(chǎn)酶培養(yǎng)基及其組成，并對(duì)發(fā)酵溫度、溶氧、pH等進(jìn)行優(yōu)化。在溫度30℃，pH值為8，轉(zhuǎn)速200r/min，搖瓶發(fā)酵50h，發(fā)酵液酶活達(dá)到275.41 U.L-1。
　　 通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、蔗糖濃縮、DEAE離子交換層析、SephadexG-75凝膠柱層析對(duì)該酶進(jìn)行純化，純化后的濃縮酶液的酶活力達(dá)到6.83U/mg。通過(guò)SDS-PAGE電泳，測(cè)定酶的分子量為58KDa,以膽固醇為底物的米氏常數(shù)3.3×10-5 m

3、ol/L，最大反應(yīng)速度為4.60mmol/(L·min)，顯示了與底物良好的親和性，從薄板層析結(jié)果看，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物單一，為有藥用價(jià)值的膽甾4-烯-3-酮。
　　 比較多種固定化酶的方法，最終確定固定化酶的材料為PVA+H3BO3+Na2CO3。并確定固定化酶最適溫度為60℃，最適pH為7.0，其熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性相對(duì)于游離酶有了很大程度的提高，通過(guò)電鏡掃描觀(guān)察固定化內(nèi)部為小而密的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使酶液很好的包埋在固定化材料內(nèi)。通過(guò)固