肝癌中c-Myc介導的microRNA-101表觀沉默機制及功能研究.pdf

1、【背景】
　　MicroRNA(miRNA)分子是近年來發(fā)現的一類普遍存在于動植物體內的內源性非編碼小RNA分子,它的廣泛下調是包括肝癌在內的眾多腫瘤的一個顯著特征。miRNA分子可通過序列特異性的互補識別,在轉錄后水平抑制靶mRNA的翻譯或將其降解來負性調控下游基因。miRNA分子在進化上的高度保守性,提示了其可能在生命功能的諸多方面發(fā)揮重要功能。據推測,存在于人體內的超過1000種的miRNA可以調控近三分之一編碼蛋白基因的表

2、達,影響著幾乎所有的信號通路。因此,肝癌中抑癌 miRNA分子廣泛下調的直接結果便是導致大量能促進肝癌發(fā)生發(fā)展的癌基因被活化。值得思考的是,目前的研究大多熱衷于挖掘腫瘤與正常組織中差異表達的miRNA,進而研究其功能,卻忽視了探尋導致這些miRNA異常表達的原因。如果能闡明肝癌中抑癌miRNA廣泛下調的具體機理,將其作為靶點來逆轉,那么將會為肝癌的臨床治療提供一種全新的有力武器。
　　癌基因EZH2在多種腫瘤的惡性進展中發(fā)揮了極為

3、關鍵的作用。研究顯示,EZH2不僅能沉默許多抑癌基因的表達,甚至在miRNA分子下調的過程中也扮演了重要角色。然而,關于 EZH2是通過何種機制來特異性沉默抑癌基因的目前仍不清楚。在肝癌中EZH2是否會和一些致癌性轉錄因子相互協作來控制抑癌miRNA的表達?在這個過程中具體有哪些關鍵的miRNA受到了影響?它們發(fā)揮的作用又是什么?這些問題目前都尚不清楚,本課題將就此展開研究。
　　【目的】
　　鑒定肝癌細胞中與 EZH2相互

4、作用的致癌性轉錄因子,并篩選出同時受 EZH2和該轉錄因子抑制的抑癌miRNA分子,進而探討這些miRNA發(fā)生沉默的具體表觀遺傳學機制及其在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用與功能,為肝癌的預防、早期診斷以及治療靶點的選擇提供新的理論依據。
　　【方法】
　　1.通過串聯質譜技術對肝癌細胞HepG2中EZH2相關復合物的組分進行分析,找到與之相互作用的致癌性轉錄因子;2.用免疫共沉淀實驗對c-Myc與EZH2蛋白的相互作用進行驗證,并

5、分析c-Myc與EZH2蛋白結合所需的關鍵結構域;3.通過miRNA芯片技術分析c-Myc或EZH2下調后HepG2細胞的miRNA表達譜,篩選出同時受這兩種基因抑制的miRNA分子,用qRT-PCR對芯片結果進行驗證;4.采用表觀遺傳學藥物5-Aza-CdR和TSA對肝癌細胞系(HepG2與SMMC-7721)進行處理,用qRT-PCR分析表觀遺傳調控對miR-101表達的影響;5.通過5’-RACE的方法確定miR-101前體的轉錄

6、起始位點(TSS),并運用重亞硫酸鹽直接測序技術分析miR-101啟動子區(qū)DNA的甲基化修飾水平;6.采用針對EZH2酶活性的小分子抑制劑 DZNep或特異性靶向 c-Myc/EZH2的siRNA對肝癌細胞 HepG2進行處理,用qRT-PCR分析c-Myc以及EZH2酶活性對miR-101(前體及成熟形式)表達的影響;7.通過染色質免疫沉淀聯合qRT-PCR(ChIP-qPCR)的方法檢測c-Myc以及PRC2各組分在 miR-101

7、啟動子區(qū)的結合情況;8.利用熒光素酶報告基因實驗分析 c-Myc和EZH2對miR-101啟動子活性的影響;9.通過軟瓊脂克隆形成實驗、Transwell細胞侵襲實驗、內皮細胞血管新生實驗以及裸鼠皮下荷瘤實驗分析 miR-101對肝癌細胞多種惡性表型的影響;10.聯合運用多種生物信息學軟件對miR-101潛在的靶基因進行預測,并將預測的靶基因用DAVID數據庫進行功能聚類分析;11.利用熒光素酶報告基因實驗鑒定miR-101直接調控的靶

8、基因,并用Western Blot實驗在蛋白水平上進行驗證;12.利用軟瓊脂克隆形成實驗、Transwell細胞遷移實驗、血管內皮細胞生長因子ELISA以及內皮細胞血管新生實驗分析miR-101是否通過調控下游靶基因STMN1、CXCR7和JUNB來影響肝癌細胞的惡性表型;13.采用成熟形式miR-101的mimics對肝癌細胞HepG2進行轉染,通過qRT-PCR檢測miR-101前體水平的改變來觀察外源性miR-101對其內源性表達

9、的影響;14.通過miRNA原位雜交和免疫組織化學的方法分析裸鼠荷瘤組織與肝癌臨床樣品組織中miR-101、c-Myc、EZH2、EED、JUNB、STMN1及CXCR7的表達情況,并用qRT-PCR和Western Blot實驗檢測這些分子在3例正常肝組織與7例肝癌組織中的表達水平,分析miR-101和這些基因的臨床相關性;15.通過qRT-PCR和免疫組織化學的方法對包含54例肝癌臨床樣品的組織芯片進行檢測,分析c-Myc和EZH2

10、異常表達對miR-101水平的影響,并采用c-Myc與EZH2雙分子聯合對這群肝癌病人的預后進行分析。
　　【結果】
　　1.質譜分析的結果顯示,在肝癌細胞HepG2中,EZH2相關復合物中不僅包含了 PRC2的其他組分,而且還含有一個重要的致癌性轉錄因子 c-Myc;2.免疫共沉淀實驗證實c-Myc與EZH2確實能夠發(fā)生相互作用,并且這種作用依賴于c-Myc蛋白的MBII和bHLH-LZ結構域;3. miRNA芯片結果顯示

11、,miR-101等10種miRNA在肝癌細胞HepG2中同時受到c-Myc和EZH2的抑制,qRT-PCR證實在干涉c-Myc或EZH2后miR-101的表達確實發(fā)生上調,鑒于miR-101在正常肝組織中的高豐度和在肝癌組織中的低表達,選擇miR-101進行深入研究;4. qRT-PCR結果顯示,聯合使用表觀遺傳學藥物5-Aza-CdR和TSA對肝癌細胞系(HepG2與SMMC-7721)進行刺激能顯著上調其miR-101的表達水平,而

12、單獨使用則對miR-101的表達無明顯影響;5.5’-RACE的結果顯示,miR-101-1的TSS位于其成熟序列上游9.3 kb的地方,并且在其原始轉錄本形成的過程中發(fā)生了剪接,而miR-101-2的TSS則緊鄰其成熟序列,進一步的重亞硫酸鹽測序發(fā)現,肝癌細胞中 miR-101啟動子區(qū)并未發(fā)生顯著的高甲基化;6. qRT-PCR結果顯示,干涉c-Myc或EZH2后,肝癌細胞HepG2中miR-101前體的水平會顯著上升,而用DZNep

13、抑制EZH2酶活性之后也能有效上調前體及成熟形式miR-101的表達;7. ChIP-qPCR結果顯示,c-Myc、EZH2和EED在 miR-101啟動子區(qū)有特異的結合信號且結合模式非常相似,同時該區(qū)域也能檢測到較強的H3K27me3修飾信號;8.熒光素酶報告基因實驗顯示,c-Myc和EZH2能夠協同發(fā)揮作用來抑制 miR-101啟動子的活性;9.體內及體外的功能研究表明, miR-101能顯著抑制肝癌細胞的非錨定依賴性生長能力、轉移

14、侵襲能力、促血管新生能力以及成瘤能力;10.生物信息學預測提示,miR-101可能通過抑制下游的EZH2、EED、JUNB、STMN1、CXCR7等基因來影響染色質重塑、血管新生、細胞生長及遷移等過程;11.熒光素酶報告基因與Western Blot實驗證實,EZH2、EED、JUNB、STMN1和CXCR7確實是miR-101直接調控的下游靶基因;12.進一步的體內及體外功能研究表明,miR-101可通過抑制這些下游靶分子來逆轉肝癌細

15、胞多種相關惡性表型;13. qRT-PCR結果顯示,只需瞬時轉染一次外源性miR-101就能顯著并持久地提升肝癌細胞中內源性miR-101前體的表達;14. miRNA原位雜交及免疫組織化學的結果顯示,在裸鼠荷瘤組織與肝癌臨床樣品組織中miR-101的表達缺失,而c-Myc、EZH2、EED、JUNB、STMN1、CXCR7則是異常高表達,進一步對3例正常肝組織及7例肝癌組織的分析發(fā)現,miR-101與這些分子的表達水平呈顯著負相關;1

16、5.肝癌組織芯片的分析結果顯示,c-Myc和EZH2同時高表達的肝癌組織中miR-101水平最低且患者的預后最差,而c-Myc和EZH2都不表達的肝癌組織中miR-101水平則相對較高并且患者的預后也最好。
　　【結論】
　　1.在肝癌細胞中,癌基因c-Myc首先結合到miR-101的啟動子區(qū)并募集以EZH2為核心的PRC2復合物,進而催化組蛋白發(fā)生H3K27me3的修飾,最終導致miR-101的表觀遺傳學沉默;2. miR