腎細(xì)胞癌中WNK2基因甲基化狀態(tài)與mRNA表達(dá)的研究.pdf

1、目的:腎細(xì)胞癌(Renal Cell Carcinoma，RCC)是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，其惡性程度較高，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，近年來其發(fā)病率仍處于上升趨勢。目前，RCC的發(fā)病機(jī)制還未完全清楚，流行病學(xué)調(diào)查研究顯示:吸煙、肥胖、高血壓、糖尿病、遺傳等因素可能與腎細(xì)胞癌的發(fā)生有關(guān)。抑癌基因的失活是惡性腫瘤發(fā)生的重要原因之一。隨著表觀遺傳學(xué)的不斷發(fā)展，目前發(fā)現(xiàn)多種表觀遺傳學(xué)修飾方式，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和RNA干擾等

2、，其中DNA甲基化是最重要的修飾方式之一。許多觀點(diǎn)認(rèn)為，抑癌基因的失活與DNA啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有蛋白激酶在激酶結(jié)構(gòu)域第2亞單位有一個(gè)高度保守的賴氨酸，但在WNK激酶中缺失此賴氨酸，因此得名Withno K kinase（K代表賴氨酸），縮寫為WNK。WNK2是WNK家族成員之一，位于人類染色體9q22.31，是新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)抑癌基因。WNK2基因主要通過表皮生長因子（Epidermal growth facto

3、r，EGF）介導(dǎo)的Ras/Raf/絲裂原激活蛋白激酶的激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MEK)/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)信號(hào)傳導(dǎo)通路和Rac/p21活化激酶(p21 activated kinase，PAK)信號(hào)傳導(dǎo)通路之間的串話機(jī)制來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。最初在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)WNK2基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化導(dǎo)

4、致其表達(dá)沉默，隨后在腦膜瘤、胰腺導(dǎo)管腺癌中也發(fā)現(xiàn)了WNK2基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化。但是，WNK2基因與RCC之間的相關(guān)研究還未見報(bào)道。本課題以RCC組織、癌旁組織及正常腎組織為標(biāo)本，研究WNK2基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)及mRNA表達(dá)水平，同時(shí)分析它們與臨床數(shù)據(jù)之間的關(guān)系，探討WNK2基因在RCC發(fā)生及發(fā)展中的作用，目地為RCC的病因、臨床診斷和治療提供新的思路。
　　方法:
　　1、WNK2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)檢測:應(yīng)用甲

5、基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Methylation Specific PCR，MSP)法檢測58例RCC組織及相對(duì)應(yīng)的癌旁組織和正常腎組織中WNK2基因的甲基化狀態(tài)，并分析WNK2基因的異常甲基化在RCC發(fā)生、發(fā)展中的作用以及與臨床數(shù)據(jù)間的關(guān)系。
　　2、WNK2基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測:采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse Transcriptase-PCR，RT-PCR）法檢測WNK2基因mRNA在58例RCC組織及相對(duì)

6、應(yīng)的癌旁組織和正常腎組織中的相對(duì)表達(dá)量，并分析在RCC組織中WNK2基因mRNA相對(duì)表達(dá)量和臨床數(shù)據(jù)間的關(guān)系。
　　3、采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包SPSS20.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:
　　1、RCC組織中WNK2基因甲基化狀態(tài)
　　RCC組織中WNK2基因甲基化狀態(tài)有三種:即完全甲基化、半甲基化、完全非甲基化。
　　2、RCC組織、癌旁組織和正常腎組織中WNK2基因甲基化狀態(tài)及與臨床資料之間的關(guān)系

7、　　2.1 RCC組織、癌旁組織和正常腎組織中WNK2基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)及比較
　　在58例RCC組織、58例癌旁組織和58例正常腎組織中WNK2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽性率分別為65.5％(38/58)，34.4％(20/58)，10.3％(6/58)，三組間存在明顯差異(X2=38.161，P=0.000)。RCC組織的甲基化陽性率明顯高于癌旁組織(X2=11.172，P=0.001)及正常組織(X2=37.495，P=0.

8、000)。
　　2.2 RCC組織中WNK2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)在不同臨床資料間的比較
　　WNK2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)在性別(P=0.820)、年齡(P=0.134)、分期(P=1.000)、腫瘤大小(P=0.718)這些不同臨床資料之間的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均大于0.05)。
　　3、58例RCC組織、58例癌旁組織和58例正常腎組織中WNK2基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，以及RCC組織中WNK2基因mRNA相對(duì)表

9、達(dá)量與臨床資料之間的關(guān)系
　　3.1在58例RCC組織、58例癌旁組織和58例正常腎組織中WNK2基因相對(duì)表達(dá)量分別為0.54±0.03、0.66±0.05、0.68±0.03，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，三組之間有顯著差異(P＜0.05)。WNK2基因mRNA在RCC組織中的相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁組織(P＜0.05)及正常腎組織（P＜0.05）。
　　3.2 WNK2基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量與性別(P=0.142)、年齡(P=0.217

10、)、腫瘤大小(P=0.145)這些不同臨床資料之間的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均大于0.05）。
　　4、在RCC組織中，WNK2基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量在甲基化陽性病例中為0.52±0.04低于甲基化陰性病例中mRNA的相對(duì)表達(dá)量0.57±0.02，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1、在正常腎組織、癌旁組織和RCC組織中，WNK2啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽性率呈升高趨勢，提示W(wǎng)NK2基因啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化可能參與