免疫增效型廣譜抗腫瘤血管生成基因疫苗的基礎研究.pdf

1、背景與目的：
　　 上世紀70年代由Judah Folkman提出的有關腫瘤血管生成的理論已被廣泛接受，目前，抗腫瘤血管生成已經(jīng)成為腫瘤學基礎研究及臨床治療領域中最有前景的策略之一。大量研究證據(jù)表明，在眾多的血管生成刺激因子中，內皮生長因子（VEGF）及其受體VEGFR2（鼠中稱為flk-1，人中稱為KDR）對于與腫瘤生長及轉移密切相關的血管生成是最重要的，許多旨在通過打破VEGF/VEGFR2傳導通路抑制腫瘤血管生成的主動免疫

2、實驗研究都取得了比較理想的結果，還有研究表明，與全長基因疫苗相比，編碼VEGFR2胞外1-4區(qū)的基因疫苗同樣能夠有效降低小鼠血清中VEGF水平，從而抑制腫瘤的生長及轉移。
　　 構建一種能夠誘導有效免疫反應基因疫苗的關鍵是打破對靶抗原的自身免疫耐受，在這項研究中我們主要采取三項措施解決這一問題。首先，選取異種同源的小鼠VEGFR2胞外1-4 IgG樣區(qū)域（簡稱mVEGFR2（1-4））作為疫苗的靶抗原；其次，將人白細胞介素12（

3、hIL-12）融合基因插入到載體IRES序列的下游，構建一個下游可以同時表達hIL-12雙亞基的雙順反子真核表達載體pVAX1-IRES-hIL12，hIL-12作為對體內細胞和體液免疫系統(tǒng)作用最強的免疫活性因子及一種抗血管生成因子，在基因疫苗中以免疫佐劑的形式發(fā)揮作用；最后，為了增強本疫苗的免疫粘附及抗原遞呈功能，本研究利用真核表達載體pCI-Fc-GPI，實現(xiàn)了人Igκ前導信號肽、人IgG-Fc段及GPI與靶抗原mVEGFR2（1-

4、4）的共同表達，成功構建了免疫增效型廣譜抗腫瘤血管生成基因疫苗pVAX1-sig-mVEGFR2（1-4）-Fc-GPI-IRES-hIL12（簡稱pVAX1-mVEGFR2-hIL12）。
　　 方法：
　　 通過搭橋PCR獲得人白細胞介素12 P35及P40雙亞基的融合基因P35-F2A-P40，插入已構建好的DNA疫苗載體pVAX1-IREST游，構建質粒載體pVAX1-IRES-hiL12；通過RT-PCR的方法

5、從Balb/c小鼠胚胎組織中特異性擴增mVEGFR2（1-4）基因，連接到真核表達載體kpVAX1-IRES-hIL12的上游，構建基因疫苗pVAX1-mVEGFR2-hIL12。脂質體法瞬時轉染293T細胞，用ELISA、免疫熒光和流式細胞術分別檢測293T細胞中hIL-12和mVEGFR2（1-4）基因的蛋白表達。
　　 結果：
　　 特異性擴增得到大小與mVEGFRa（1-4）基因相符的基因片段，序列測定證實與Ge

6、nBank（GI：57923）上登錄的序列一致；酶切鑒定和序列分析表明P35及P40雙亞基融合基因P35-F2A-P40與設計完全一致，融合基因在體外細胞培養(yǎng)液檢測中獲得分泌表達；成功構建了廣譜抗腫瘤血管生成基因疫苗pVAX1-mVEGFR2-hIL12。FACS及IMF檢測證實重組基因疫苗得到有效表達。
　　 結論：
　　 成功構建了免疫增效型廣譜抗腫瘤血管基因疫苗pVAX1-mVEGFR2-hiL12，為后續(xù)研究中進