MicroRNA-135a對胰腺導管腺癌細胞增殖、凋亡的影響及相關機制的研究.pdf

1、【背景】
　　胰腺癌(pancreatic cancer,PC)是惡性程度最高的腫瘤之一,其中,胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)占90％以上。由于早期臨床癥狀隱匿,診斷困難,絕大部分PDAC患者在確診時腫瘤已出現轉移或侵襲到胰外器官而無法行根治性手術切除;此外,PDAC對放療和化療均不敏感,患者的中位生存時間不到6個月,5年生存率小于5%,預后極差。近年來,我國及西方國家的

2、PDAC發(fā)病率及死亡率均呈上升趨勢。隨著生物技術的迅速發(fā)展,PDAC的相關分子生物學研究對于闡明PDAC發(fā)病機制,提高PDAC診治水平,改善患者預后具有重要意義。
　　MicroRNA(miRNA)是由17～25個核苷酸所組成的非編碼小分子單鏈RNA,具有高度保守性,通過與靶基因mRNA的3’端的非翻譯區(qū)(3’-UTR)結合,降解或者抑制mRNA的翻譯,實現對靶基因的負調控。研究發(fā)現,miRNAs在許多生物學進程中發(fā)揮重要作用,其

3、異常表達與多種疾病相關。在腫瘤研究領域,miRNAs涉及腫瘤發(fā)生、發(fā)展代謝、耐藥等多個方面,并具有組織特異性,通過調控眾多腫瘤相關基因的表達,發(fā)揮類似于原癌基因或者抑癌基因的作用。目前,有關miRNAs在PDAC的研究涵蓋了腫瘤細胞增殖、凋亡、分化、侵襲轉移和耐藥等方面。對比分析PDAC細胞系、組織樣品、體液及小動物模型相對于正常組的miRNA表達譜變化,發(fā)現其表達譜存在顯著差異,一部分miRNAs的表達上調,如miR-21,miR-1

4、55,miR-10b,miR-196,miR-221,miR-301,miR-95等,而另一些miRNAs則表達下調,如miR-217,miR-216,miR-375,miR-203等。這些異常表達的miRNAs調控的靶基因有KRAS,PTEN,PDCD4,ZEB1,BCL-2,TIMP3等等。但是現階段的研究仍存在很多尚未闡明的問題,關于PDAC中miRNAs及其靶基因的調控網絡構建和作用機制方面還需進一步的研究。miR-135a被證

5、實在許多腫瘤中發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖,促進腫瘤細胞凋亡等作用,但在胰腺癌中的作用尚未見有相關研究。
　　Bmi1(B-ceIl-specific Moloney murine leukemia virus integration site1)基因,屬于多梳基因PcG(polycomb group genes)家族。Bmi1基因在細胞周期、細胞永生化和衰老的調解中發(fā)揮重要作用。近年來,許多研究證實了Bmi1基因還參與了干細胞的自我更新

6、和分化。Bmi1基因與腫瘤關系密切,通常被認為是一個重要的癌基因。肺癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤、肝癌和胰腺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展都和Bmi1的異常表達有關。通過生物信息學預測與分析,我們推測Bmi1基因是miR-135a的潛在靶基因之一。
　　miR-135a是否參與PDAC的發(fā)生和發(fā)展?其在PDAC中的功能是什么?這些功能是否是通過調控Bmi1來實現的?因此,miR-135a在PDAC發(fā)生、發(fā)展中的作用和機制還需進一步研究。

7、r>　　【目的】
　　通過miRNA表達譜芯片篩選 PDAC細胞系及正常胰腺導管上皮細胞系中發(fā)生差異表達的miRNA分子,確定研究對象(即 miR-135a)后探討其在 PDAC發(fā)生發(fā)展中的相關功能和機制,為PDAC的診療尋找新的靶點。
　　【方法】
　　1.本實驗選用高通量的Agilent Human microRNA array kit(V18.0)檢測3種PDAC細胞系(PANC-1、BxPC-3和ASPC-1)

8、及1種正常胰腺導管上皮細胞系(HPDE6c7)中的miRNAs表達情況。并采用實時定量PCR(qRT-PCR)的方法在腫瘤組織及細胞系中驗證部分差異表達的miRNAs,結果證明芯片檢測準確、可靠,并且挑選miR-135a作為研究對象。
　　2.構建過表達miR-135a的慢病毒載體Lenti-miR-135a,轉染PDAC細胞系,通過細胞計數試劑盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8),克隆形成實驗、EdU細胞增殖

9、檢測實驗、流式細胞術、Transwell實驗及 Matrigel實驗等方法觀察其對細胞增殖、生長、侵襲和遷移的影響。并通過裸鼠皮下成瘤實驗來觀察miR-135a對PDAC增殖能力的影響。
　　3.miR-135a下游靶基因的預測、驗證及相關機制研究:利用 miRanda、Pita,及 RNAhybrid等靶基因預測軟件,結合相關因素進行分析,篩選出 Bmi1可能為miR-135a的下游靶基因。在PDAC細胞中過表達或抑制miR-1

10、35a后利用實時定量RT-PCR和免疫印跡實驗(western blotting)檢測Bmi1基因mRNA和蛋白水平的改變。之后采用熒光素酶報告實驗驗證miR-135a對Bmi1的調控作用。然后,western blotting檢測上述轉染細胞中細胞周期及凋亡相關分子p21,cyclin D1,Cdk2,Cdk4,Akt,pAkt,Bcl-2,Bax的變化。
　　【結果】
　　1.Agilent human miRNA芯片檢

11、測結果顯示,與正常胰腺導管上皮細胞系相比,PDAC細胞系中表達上調的miRNA有23個(fold change>2),包括 miR-21,miR-10a-5p,miR-10b-5p和miR-301a-3p等,表達下調的有43個(fold change<0.5),如miR-205-3p,miR-203,miR-630以及miR-135a等。結合既往文獻報道的差異表達的miRNAs,芯片檢測結果可準確性及可靠性高。通過芯片篩選及查閱相關文獻

12、,我們發(fā)現 miR-135a在肺癌、腎癌、胃癌等惡性腫瘤中的表達均有明顯的降低并和細胞增殖、凋亡等惡性表型相關,但是在PDAC中的表達變化及其功能未見報道。所以我們選擇 miR-135a作為進一步的研究對象。為驗證芯片篩選結果,我們還采用實時定量RT-PCR對miR-135a在PDAC細胞系及組織中的表達狀況進行了驗證,發(fā)現相較于癌旁正常組織和正常胰腺導管上皮細胞系,miR-135a在 PDAC組織和細胞系的表達均顯著下調,結果與芯片結

13、果相一致。提示miR-135a在 PDAC的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用。
　　2.轉染Lenti-miR-135a后,采用CCK-8檢測細胞生長曲線結果提示,與對照組相比,轉染組細胞增殖能力減弱;平板克隆形成實驗結果提示,與對照組相比,轉染組細胞克隆形成能力減弱;EdU實驗結果提示,與對照組相比,轉染組細胞增殖能力減弱。流式細胞儀檢測細胞周期與細胞凋亡實驗結果提示,與對照組相比,轉染組細胞增加了G0?G1期細胞的比例,G2/M

14、期的細胞的比例下降,并且增加了凋亡細胞的數量。裸鼠皮下成瘤實驗提示,與對照組相比,注射轉染組細胞的裸鼠成瘤能力顯著減弱。Transwell小室實驗的結果則提示miR-135a對PDAC細胞的遷移與侵襲能力無明顯影響。
　　3.生物信息學預測提示,Bmi1可能是miR-135a作用的靶基因之一,采用western blotting檢測 PDAC細胞系及組織中的Bmi1基因的蛋白表達情況,發(fā)現其表達與miR-135a的表達呈負相關。過

15、表達或抑制 miR-135a對 Bmi1基因的mRNA水平無明顯影響,但卻對其蛋白水平則呈負性調控作用。熒光素酶報告基因實驗證實miR-135a可以抑制含有其結合位點的報告基因的活性,而對含突變位點的質粒及對照質粒沒有影響。進一步驗證了生物信息學軟件的預測結果。
　　4.western blotting檢測PDAC細胞中細胞周期相關分子p21,cyclin D1,Cdk2,Cdk4的變化。發(fā)現與對照組相比較,過表達miR-135a

16、后細胞中cyclin D1,Cdk2,Cdk4的表達明顯下調,p21的表達則上調。而同時轉染 miR-135a mimics與pcDNA-Bmi1(mutant3’-UTR for miR-135a)后,與僅過表達miR-135a組細胞相比,上調了cyclin D1,Cdk2,Cdk4的表達,p21的表達則下調。western blotting檢測細胞凋亡相關分子表達發(fā)現,與對照組相比較,過表達miR-135a后細胞中phospho-A

17、kt和Bcl-2的表達受到抑制,Bax表達水平則升高,同時轉染 miR-135a mimics與pcDNA-Bmi1(mutant3’-UTR for miR-135a)后,與僅過表達miR-135a組細胞相比,phospho-Akt和Bcl-2表達升高,Bax的表達被抑制。
　　【結論】
　　1.高通量 miRNA芯片檢測結果及實時定量 RT-PCR實驗提示 miR-135a在PDAC細胞系和組織中的表達較正常胰腺導管上皮