SP納米緩釋微粒的制備以及對脾細胞功能的影響.pdf

1、前言
　　P物質(SubstanceP，SP)是發(fā)現(xiàn)最早的神經肽之一。通過重組DNA技術研究SP，發(fā)現(xiàn)SP來源于前速激肽原(Pre-Protachykinin，PPT)，因此SP屬于速激肽(Tachykinin，TK)成員。研究發(fā)現(xiàn)SP是神經內分泌免疫網絡中的重要一員，是神經內分泌和免疫系統(tǒng)共同的化學語言。
　　NK細胞屬于大顆粒淋巴細胞，是天然免疫系統(tǒng)的重要組分。成熟NK細胞主要聚集于脾臟、肝臟和外周血。研究表明，NK細胞

2、可通過細胞介導的細胞毒作用殺傷非己細胞，并通過釋放多種細胞因子和趨化因子來調節(jié)天然免疫和獲得性免疫。根據表面標志和功能的不同，可以將NK細胞分為不同的亞群。小鼠NK細胞庫是由不同表型、功能的NK細胞亞群組成。CD27與CD11b聯(lián)合可以作為小鼠NK細胞亞群劃分的依據，因成熟小鼠NK細胞高表達CD11b，因此可將成熟小鼠NK細胞劃分為CD11bhiCD27hi、CD11bhiCD27lo兩個亞群。這兩個細胞亞群在免疫應答的過程中發(fā)揮著不同

3、的生物學功能。
　　雖然SP主要通過NK細胞表面的相應神經肽受體來介導其生物活性，但這種活化機制大多局限于體外，體內機制國內外研究較少，且缺乏全面系統(tǒng)性，但若將此肽類藥物直接用于臨床試驗會有諸多局限性，如藥物在血漿中的濃度范圍波動較大或由于代謝迅速而導致難以達到有效血藥濃度等。因此，新的藥物輸送系統(tǒng)，在新藥的研發(fā)和應用過程中，有越來越重要的地位。納米給藥系統(tǒng)（俗稱藥物納米粒）的出現(xiàn)，為解決這些問題提供了可能。藥物納米粒，是近年來藥

4、劑學領域研究頗為活躍的一系列新型超微小給藥系統(tǒng)的統(tǒng)稱，其粒徑多在10～500nm之間。由于納米粒子的微小體積和特殊結構，使之在控、緩釋給藥，靶向給藥，黏膜和局部給藥以及基因工程等領域中顯示出特殊的優(yōu)勢。因此，研制SP的納米粒使SP能在體內較長時間存在，有利于觀察SP對機體免疫功能的長期作用，其研究結果將對神經肽的臨床應用提供新的理論依據。
　　方法
　　1、采用復乳法制備SP納米粒①精確稱取SP1mg，溶入含0.4％吐溫80

5、的500μl雙蒸水中。②加入到含2.5％聚乳酸(PLGA)的2ml二氯甲烷溶液中，超聲5min使分散形成均一穩(wěn)定的初乳。③將該乳液在超聲條件下加入到8ml2％聚乙二醇(PVA)水溶液中，置于冰水中再分散，形成復乳。④將該復乳液室溫下磁力攪拌3h使有機溶劑揮發(fā)，得膠體混懸液。將該膠體液以10000轉/min，冷凍離心三次，每次10min，沉淀物真空凍干燥得凍干粉，密封后置于4℃保存，即得SP納米微粒。
　　2、SP納米粒的穩(wěn)定性質研

6、究取適量SP納米粒凍干粉超聲分散于無水乙醇中，透射電鏡下觀察微粒形態(tài)和大小。同時測量微粒的平均粒徑。制備3批SP納米粒，常規(guī)考察其色澤外觀及再分散情況。將SP納米粒凍干粉置于4℃冰箱中，3個月后取出再分散于生理鹽水中，觀察乳狀液的各項指標，了解其穩(wěn)定性。
　　3、SP納米粒載藥率、包裹率的測定新制備的混懸膠體液冷凍離心后收集上清液，用ELISA試劑盒測定上清液中SP的含量，從而得出未被包裹的SP量，進而計算SP納米粒的載藥率和包裹

7、率。
　　4、SP納米粒的體外釋藥試驗精密稱取含2μg的SP納米粒置于離心管中，每個離心管中加入生理鹽水至1ml，再置于4℃水浴箱中恒溫震蕩。按1、2、4、8、12、24、36h定時取樣，以ELISA試劑盒測定不同時點的上清液中SP濃度，取樣后加入生理鹽水恢復原體積。
　　5、SP納米粒的體內釋藥試驗取C57BL/6純系小鼠，分PBS組、空白顆粒組、SP組、SP納米粒四組。肌肉注射后，在5、10、15、20、25min各時間

8、點，每組選3只小鼠眼球取血，分離血清，ELISA法檢測血清中SP濃度。
　　6、CCK8法檢測SP對小鼠脾細胞的殺傷活性。
　　7、流式細胞術檢測SP對小鼠脾細胞功能的影響。
　　8、Real-TimePCR法檢測SP對小鼠脾細胞殺傷介質（穿孔素、顆粒酶B）和活化受體(NKG2D、NKp46)的mRNA表達的影響。
　　實驗結果
　　1、SP納米粒的一般性質。
　　SP納米粒膠體懸液混懸透明。透射電鏡

9、下，該納米粒表面光滑，均勻度好，粒徑分布均勻，平均粒徑50nm。凍干粉為白色疏松粉末。4℃下放置3個月后，凍干粉的再分散性良好，在生理鹽水中分布呈混懸膠體狀，無沉淀，表明SP納米粒的穩(wěn)定性及再分散性良好。
　　2、SP納米粒的平均載藥率為1.11％±0.036，平均包裹率為84.37％±3.56。
　　3、SP納米粒的體外釋藥試驗:SP納米粒在36h內能一直持續(xù)釋放SP，說明SP具有明顯的緩釋效果。
　　4、SP納米粒

10、的體內釋藥試驗
　　與對照組相比，空白顆粒組血清中SP含量在各時間點內變化不大，SP組和SP納米粒組在各時間點內血清中SP含量差異顯著。其中，SP組在第15min時的血清中SP含量達到最大值，此后量值呈下降趨勢;SP納米粒組在各時間點內的血清SP含量呈穩(wěn)定上升趨勢。
　　5、與對照組相比，空白顆粒組中小鼠脾細胞的殺傷活性沒有明顯差異，其余各組均有明顯差異。其中，SP組的中劑量部分較高、低劑量部分的殺傷活性高;納米高劑量組較納

11、米中、低劑量組的殺傷活性高。
　　6、各組藥物連續(xù)5天免疫小鼠后，F(xiàn)CAS檢測結果表明，SP組（低、中、高濃度）和納米組（低、中、高濃度）均可增強小鼠脾細胞CD27的表達率。其中，脾臟中的SP低劑量組和納米粒低劑量組對CD27的影響顯著。
　　7、SP組（低、中、高濃度）和納米組（低、中、高濃度）均可顯著提高小鼠脾細胞殺傷介質（穿孔素、顆粒酶B）和活化受體(NKG2D、NKp46)的mRNA表達水平。
　　結論

12、　　1、SP納米粒具有易于合成、質量穩(wěn)定、降解速度可調節(jié)等優(yōu)點。本實驗采用復乳法制備SP納米粒，實驗結果表明SP納米粒球體均勻度好，凍干粉為白色疏松粉末，再分散性良好。
　　2、本研究測定了3批次SP納米粒的載藥率和包裹率，結果均相差不大，表明制備工藝有良好的穩(wěn)定性和可重復性。
　　3、SP納米粒的體內、外釋藥試驗說明SP具有明顯的緩釋效果。
　　4、一定濃度的SP可增強小鼠脾細胞的殺傷活性，并能提高小鼠脾細胞殺傷介質