PEBP4在非小細胞肺癌分化轉移中的作用研究.pdf

1、背景:肺癌為當前世界各地最常見的惡性腫瘤之一,是一種嚴重威脅人類健康的疾病,隨著肺癌發(fā)病率和死亡率的不斷升高,肺癌越來越引起廣大研究者的關注?；熑匀皇欠伟┲委煹某Ｓ梅椒?因此,探尋與研究肺癌化療敏感性相關基因是一項迫在眉睫的任務,藉此提高肺癌患者生存率,改善預后。隨著人類基因組計劃的完成及分子生物學的發(fā)展,人們在基因水平上對腫瘤的發(fā)生發(fā)展的認識取得了很大的成就,但離攻克癌癥仍然有很遠的路要走。
　　PEBP4屬于磷脂酰乙醇胺結合

2、蛋白家族的成員,不僅參與MAPK信號通路的抑制作用,還參與JNK通路的抑制,促進AKT的激活,近年來研究數(shù)據(jù)表明PEBP4蛋白的過表達與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及浸潤轉移密切相關。PEBP4在乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌細胞和組織中的表達均高于其在正常對照組中的表達,在腫瘤組織中高表達的PEBP4可能使腫瘤細胞對TNF-α(tumor necrosis factor-α) or TRAIL(tumor necrosis factor-relat

3、ed apoptosis-inducing ligand)引起的凋亡起抵抗作用。但有關PEBP4是否在肺鱗狀細胞癌中表達以及與肺鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展關系的研究仍未見相關報道。
　　本課題研究了PEBP4的表達與肺非小細胞癌的臨床病理的相關性以及PEBP4在非小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展和侵襲轉移中的作用,非小細胞肺癌的早期診斷和腫瘤靶向治療提供實驗依據(jù)。本文從以下幾部分進行了論述。
　　第一部分 PEBP4蛋白在肺非小細胞癌組織中的表達

4、及其意義
　　目的:本研究旨在探討PEBP4蛋白在肺鱗狀細胞癌組織中的表達及其與肺鱗狀細胞癌臨床病理的相關性。
　　方法:采用免疫組織化學方法檢測61例肺鱗狀細胞癌組織及其癌旁正常組織中PEBP4蛋白的表達,計算其陽性率;并Western blot方法檢測肺鱗狀細胞癌組織及其癌旁正常組織中PEBP4蛋白的表達變化,用RT-PCR和Western blot方法檢測淋巴結轉移陽性和陰性患者癌組織中mRNA和蛋白表達情況。

5、　　結果:PEBP4蛋白在肺鱗狀細胞癌組織中的表達顯著高于癌旁正常肺組織(p<0.05);PEBP4 mRNA在淋巴結轉移陽性患者癌組織中的表達量顯著高于淋巴結轉移陰性患者(p<0.05),PEBP4蛋白的表達也顯著高于淋巴結轉移陰性患者(p<0.05),;PEBP4蛋白在早期(I,II)患者中的表達顯著低于中晚期(III,IV)患者(p<0.05),且隨著肺鱗狀細胞癌組織分化程度降低,PEBP4蛋白的表達越高(p<0.05),但與患者

6、的性別、年齡、腫瘤的大小等無關(p<0.05)。
　　結論:PEBP4蛋白的高表達可能與肺鱗狀細胞癌的發(fā)生及侵襲轉移有關。
　　第二部分 PEBP4基因表達與非小細胞肺癌侵襲轉移之間的關系
　　目的:探討 PEBP4基因對于非小細胞肺癌細胞生長、增殖、凋亡及浸潤轉移等生物學行為的影響,為將來人非小細胞肺癌的生物治療提供實驗依據(jù)。
　　方法:采用Western blot方法檢測非小細胞肺癌細胞系(HCC827,A5

7、49,NCI-H661, NCI-H292 and95-D)中PEBP4蛋白的表達情況,再用siRNA干擾技術下調HCC827細胞中PEBP4表達,觀察HCC827細胞侵襲能力。用PEBP4-siRNA干擾表達載體轉染人HCC827細胞,檢測相關生物學行為。
　　結果:PEBP4在肺癌細胞系(HCC827,A549,NCI-H661,NCI-H292 and95-D)中的高表達,在正常支氣管細胞中呈低表達。PEBP4干擾組HCC8

8、27細胞的活力、增殖能力以及遷移能力明顯低于陰性對照組和空白對照組 HCC827細胞(p<0.05), PEBP4干擾組發(fā)生凋亡的HCC827細胞所占比例明顯高于陰性對照組和空白對照組(p<0.05),PEBP4干擾組HCC827細胞中Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2及MMP-9蛋白表達水平明顯低于陰性對照組和空白對照組(p<0.05),p53蛋白表達水平明顯高于陰性對照組和空白對照組(p<0.05)。
　　結論:PEB

9、P4基因可能具有促進 HCC827細胞生長增殖及其侵襲遷移能力,抑制HCC827細胞凋亡的作用,PEBP4基因的表達下調可能與人非小細胞肺癌HCC827細胞遷移能力下降、凋亡能力增加有關。
　　第三部分 PEBP4的異位表達對順鉑誘導的細胞毒性之間的關系
　　目的:檢測肺癌細胞系A549中 PEBP4的異位表達對順鉑誘導的細胞毒性之間的關系,并探討其相關作用機制。為將來PEBP4在人肺癌的化療中應用提供實驗依據(jù)。方法:構建p

10、cDNA3-PEBP4重組質粒,將pcDNA3-PEBP4重組質粒和PEBP4 shRNA轉染肺癌細胞A549,Western Blot檢測各組A549細胞中PEBP4的表達。MTT分別檢測pcDNA3-PEBP4重組質粒和PEBP4 targeting shRNA轉染的A549細胞,在順鉑(DDP)作用48小時后,各組A549細胞活力的變化;利用流式細胞儀檢測各組A549細胞凋亡的變化;并利用Western Blot檢測各組A549細

11、胞中p53蛋白的表達變化。應用熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證PEBP4是miR-34a的靶基因。采用Western blot方法檢測miR-34a對A549細胞中PEBP4蛋白表達的影響。
　　結果:成功構建了pcDNA3-PEBP4重組表達質粒。pcDNA3-PEBP4重組質粒和PEBP4 targeting shRNA轉染A549細胞后,Western Blot結果顯示:pcDNA3-PEBP4轉染組PEBP4蛋白的表達顯著高于正常

12、對照組和PEBP4 shRNA轉染對照組(p<0.05);PEBP4 targeting shRNA轉染組,PEBP4蛋白的表達顯著下降(p<0.05)。DDP作用48h后, MTT結果顯示:DDP加藥組的A549細胞活力顯著低于正常對照組(p<0.05);pcDNA3-PEBP4轉染組A549細胞活力低于正常對照組(p<0.05),卻高于DDP加藥組和PEBP4 shRNA轉染組(p<0.05);PEBP4 shRNA轉染組細胞活力則

13、顯著低于正常對照組p<0.05)和DDP加藥組(p<0.05)。流式細胞儀檢測結果和Western Blot結果顯示:DDP加藥組的凋亡細胞數(shù)和p53蛋白的表達水平顯著高于正常對照組(p<0.05);pcDNA3-PEBP4轉染組凋亡細胞數(shù)和 p53的表達水平高于正常對照組(p<0.055),卻低于DDP加藥組和PEBP4 shRNA轉染組(p<0.05);PEBP4 shRNA轉染組凋亡細胞數(shù)和p53的表達水平則顯著高于正常對照組(p

14、<0.05)和DDP加藥組(p<0.05)。熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測結果顯示:與對照組相比,轉染miR-34a mimic組的相對熒光素酶活力顯著降低(p<0.05)。Western blot檢測結果顯示:與對照組相比,在A549細胞中轉染miR-34a mimic48h后,細胞中PEBP4蛋白的表達顯著下降(p<0.01)。
　　結論:PEBP4的過表達降低A549細胞對DDP誘導的細胞毒性的敏感性,這一過程主要通過影響p53蛋