尿毒癥高轉化骨病大鼠BM-MSC培養(yǎng)鑒定及增殖分化的信號轉導機制.pdf

1、背景與目的:尿毒癥高轉化骨病與尿毒癥狀態(tài)下成骨細胞數(shù)量及功能的異常增加有密切關系，其確切機制目前尚未明確。骨髓間充質干細胞(BM-MSC)增殖并向成骨細胞分化是骨形成的細胞生物學基礎，但目前尚無尿毒癥高轉化骨病大鼠BM-MSC體外培養(yǎng)及增殖、分化的報道。我們最近首次發(fā)現(xiàn)尿毒癥高轉化骨病大鼠骨髓基質細胞向成骨細胞分化的能力增加。本研究通過體外培養(yǎng)、鑒定尿毒癥高轉化骨病大鼠BM-MSC，觀察其增殖、分化行為特征及相關的信號轉導機制改變。

2、r>　　 方法:取180-200g Sprague-Dawley雄性大鼠，制做5/6腎切除并高磷飲食（磷1.2％，鈣1.0％）喂養(yǎng)的尿毒癥高轉化骨病組模型大鼠。以正常磷飲食(0.9％，鈣1.0％)喂養(yǎng)的相同體重雄性大鼠作為對照組。12周后處死大鼠，取股骨和脛骨骨干，利用骨片貼壁分離篩選法原代培養(yǎng)BM-MSC。取第3代細胞，進行流式細胞儀鑒定BM-MSC分子標志(CD90+/CD34-/CD44+/CD45-)。采用MTT法觀察尿毒癥高

3、轉化骨病組大鼠與對照組大鼠BM-MSC細胞增殖行為改變，并應用流式細胞儀法檢測BM-MSC中DNA含量，分析兩組細胞之間細胞周期的差異。免疫組化及免疫印跡法(western-blot)檢測兩組細胞之間增殖相關信號通路分子表達的差異。在含有磷酸甘油及地塞米松的成骨培養(yǎng)基中，誘導BM-MSC分化為成骨細胞，采用免疫組化法，分析比較尿毒癥高轉化骨病組與對照組BM-MSC分化的成骨細胞表達堿性磷酸酶(ALP)、骨橋蛋白(OPN)的差異，采用vo

4、n Kossa染色觀察兩組細胞內外磷酸鈣沉積及骨結節(jié)形成數(shù)目（HE染色）等成骨細胞特征性標志物的差異。
　　 結果:(1)利用骨片貼壁分離篩選法可成功分離、培養(yǎng)尿毒癥高轉化骨病組大鼠及對照組大鼠的原代BM-MSC。取第3代培養(yǎng)細胞，經流式細胞術鑒定為CD90+/CD34-/CD44+/CD45-細胞，符合BM-MSC的分子標志特征。(2)流式細胞術對DNA的分析發(fā)現(xiàn)，尿毒癥高轉化骨病組大鼠BM-MSC中G1期、S期、G2/M期、

5、細胞比例分別為79.55±3.66％、20.12±1.96％、0.33±0.10％，對照組分別為84.62±3.10％、15.13±0.87％、0.25±0.11％，尿毒癥高轉化骨病組S期細胞比例明顯增加(P＜0.05)，此結果與MTT法的細胞增殖分析結果一致。(3)免疫組化結果顯示，培養(yǎng)的BM-MSC中，ERK1/2信號通路明顯激活，表現(xiàn)為p-ERK1/2與總ERK1/2的比值顯著增加(P＜0.05)。Western-blot分析顯示

6、，對照組BM-MSC細胞ERK1/2信號通路的激活從72h開始，并在其后的24h內維持于較高水平;而尿毒癥高轉化骨病組細胞ERK1/2信號通路激活從48h即已開始，并在其后的48h內一直維持于較高水平;在48h-96h內的各時間點，尿毒癥高轉化骨病組ERK1/2信號通路的激活水平均高于對照組(P＜0.05)。流式細胞術分析發(fā)現(xiàn)，使用ERK1/2信號通路阻斷劑后，兩組細胞增殖能力均顯著下降，尿毒癥高轉化骨病組S期細胞比例的下降程度較對照組

7、更為顯著(P＜0.05)，此結果與MTT法分析結果一致。(4)免疫組化法顯示，大鼠BM-MSC于體外向成骨細胞誘導分化后1周，細胞堿性磷酸酶(ALP)表達明顯增強;分化后2周，骨橋蛋白(OPN)表達明顯增強(P＜0.05)，von Kossa染色顯示，細胞內外基質磷酸鈣沉積較對照組顯著增多(P＜0.05);分化后3周，骨結節(jié)形成數(shù)目有明顯增加(P＜0.05)。
　　 結論:尿毒癥高轉化骨病大鼠BM-MSC可在體外培養(yǎng)條件下存活，