低分子量肝素對肝癌細胞株增殖、黏附相關特性的影響及機制研究.pdf

1、目的：（1）檢測低分子量肝素對體外培養(yǎng)肝癌細胞增殖的影響，通過周期及周期相關基因變化分析其分子機制。（2）檢測低分子量肝素聯(lián)合抗癌藥物順鉑后對肝癌細胞增殖的影響，分析低分子量肝素是否能夠增強肝癌細胞對抗癌藥物的敏感性，并進一步探討其可能機制。（3）檢測低分子量肝素能否影響肝癌細胞侵襲遷移過程的關鍵步驟—早期黏附，并探討其相關機制。
　　方法：（1）培養(yǎng)SMMC-7721細胞，MTT比色法檢測低分子量肝素作用后細胞生長情況。將對照組

2、和低分子量肝素處理組細胞培養(yǎng)36 h，以流式細胞術檢測細胞周期分布的變化；RT-PCR法檢測各組細胞Skp2和c-Myc mRNA的變化情況；Western Blot檢測各組Skp2和c-Myc蛋白的表達變化。（2）體外培養(yǎng)SMMC-7721細胞，實驗分為對照組、LMWH處理組、DDP處理組和LMWH聯(lián)合DDP處理組，分別給予相應的藥物處理36h后，MTT檢測各組細胞存活率；AO/EB雙熒光染色法及流式細胞術檢測各組細胞凋亡率；West

3、ern Blot檢測各組細胞的活化Caspase3、Fas、Bcl-2、Bax蛋白的表達情況。（3） Western Blot檢測正常肝細胞株L-02，肝癌細胞株SMMC-7721、HepG2三株細胞株選擇素配體SleX的表達量；RT-PCR檢測經(jīng)不同濃度肝癌細胞條件培養(yǎng)液刺激后的臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）的E-選擇素表達情況；黏附試驗檢測三株細胞與經(jīng)刺激后的HUVECs的黏附情況。（4）選擇SleX高表達細胞株HepG2作為肝癌細胞

4、株代表，分別與條件培養(yǎng)液組，條件培養(yǎng)液+LMWH低濃度組，條件培養(yǎng)液+LMWH高濃度組處理的HUVECs共培養(yǎng)，檢測發(fā)生黏附的細胞數(shù)目是否發(fā)生變化；RT-PCR檢測上述三種處理的HUVECs上E-選擇素的表達情況。
　　結(jié)果：（1）與對照組相比，經(jīng)低分子量肝素作用后的細胞的生長受到抑制，并在一定范圍內(nèi)呈時間和藥物濃度依賴性；分析細胞周期發(fā)現(xiàn)，隨低分子量肝素劑量的增加，處于S期細胞的比例下降（P<0.05），而處于G0/G1期細胞比

5、例顯著上升（P<0.05）；且Skp2和c-Myc的mRNA和蛋白的表達量均呈現(xiàn)劑量依賴性減低（P<0.05）。（2）與對照組相比，低分子量肝素小劑量應用對SMMC-7721細胞的生長抑制不明顯，但低分子量肝素聯(lián)合DDP應用后對細胞的抑制作用明顯強于單獨應用DDP處理組；凋亡檢測結(jié)果顯示，小劑量LMWH單獨應用不能明顯增加細胞的凋亡率，但LMWH聯(lián)合DDP應用后，細胞的凋亡率明顯強于DDP單獨應用組；Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)聯(lián)合

6、用藥組活化Caspase3表達明顯增強；Fas在DDP單獨用藥組和聯(lián)合用藥組表達增高，但兩者表達量差別不大；Bcl-2僅在聯(lián)合用藥組表達明顯降低，Bax僅在聯(lián)合用藥組表達明顯升高。（3）選擇素配體SleX在L-02細胞株中幾乎無表達，在SMMC-7721細胞株中為低表達，在HepG2細胞株中為高表達；HUVECs經(jīng)條件培養(yǎng)液刺激5h后，E-選擇素表達明顯增加，且具有劑量依賴性。（4）低分子量肝素作用于經(jīng)條件培養(yǎng)液刺激的HUVECs后，黏

7、附的HepG2細胞數(shù)目明顯降低，具有劑量依賴性；通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)低分子量肝素能夠劑量依賴性降低E-選擇素的表達。
　　結(jié)論：（1）低分子量肝素能抑制肝癌細胞的生長，其機制可能與降低Skp2和c-Myc的基因表達，阻滯細胞于G0/G1期，進而降低了細胞的增殖指數(shù)有關。（2）LMWH能增強DDP對肝癌細胞的增殖抑制，其機制可能是聯(lián)合應用LMWH后調(diào)節(jié)了細胞的凋亡途徑。（3） LMWH能夠通過抑制HUVECs上E-選擇素的表達降低肝