促磷脂分泌對大鼠移植肝膽管損傷的防治作用研究.pdf

1、一.目的
　　 膽道并發(fā)癥嚴重影響肝移植受體的生存及生活質量,被公認為肝臟移植的薄弱環(huán)節(jié)(Achilles'heel)。隨著人們對膽道并發(fā)癥認識的深化和外科吻合技術的提高,由外科技術原因造成的膽管吻合口并發(fā)癥及引流管相關性并發(fā)癥的發(fā)病率呈下降趨勢,而以非外科技術因素所導致的膽道并發(fā)癥仍然是制約肝臟移植遠期療效的主要因素之一。以彌漫性或局灶性的移植物膽管樹狹窄、擴張、毀損及管型形成為病理特征的缺血型膽管病變(ITBL)是非外科性移

2、植物膽管并發(fā)癥的主要類型[1],發(fā)生率為2％-19％。盡管公認冷保存/再灌注損傷(CPRI)是其發(fā)病的主要原因,但具體機制尚不清楚。近年來,疏水性膽鹽在膽道損傷中的作用受到人們的重視。疏水性膽鹽既可以通過“去垢”作用干擾生物膜的脂代謝,也可以誘導細胞凋亡,具有很強的細胞毒性[2]。人的膽鹽池95％以上由疏水性膽鹽組成。在正常情況下,人體具有一套中和疏水性膽鹽細胞毒性的自我保護機制,如磷脂可以與膽鹽形成微膠粒(micelle)以降低其細胞

3、毒性、膽汁所含的親水性膽鹽可以通過增強細胞膜的穩(wěn)定性來對抗疏水性膽鹽的細胞毒性等等。此外,膽汁主要成份的分泌完全依賴于位于肝細胞毛細膽管面的肝膽膜轉運蛋白(HMTs),HMTs基因表達異常有可能導致膽汁淤積和膽管損傷。已經有研究提示肝移植術后早期存在膽汁成份失衡的現象。綜合近年來國內外的研究結果,“毒性膽汁”假說在移植肝冷保存/再灌注膽管損傷中的作用日益受到重視。因此我們提出如下設想:如果我們能對膽汁的成分進行主動調控,增加膽汁中磷脂及

4、親水性膽鹽的比重,是否有助于中和疏水性膽鹽的細胞毒性、減輕移植肝膽管樹損傷呢?。
　　 3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑(辛伐他汀)因其對血脂的主要成份有明確作用,并有良好的危險效益比,以及此類藥物獨特的降脂效益而應用日趨廣泛。最近一些研究發(fā)現,他汀類藥物對大鼠肝膽管磷脂的分泌有顯著性影響,5天以上的長期治療可誘導肝磷酸卵磷脂(PC)的合成和促進膽汁磷脂的排出,但對膽鹽的分泌沒有影響[3]。
　　

5、 疏水性膽鹽具有很強的細胞毒性,在膽管損傷中扮演著重要角色。主動改變膽汁的成份,防止膽鹽對肝細胞及膽管上皮細胞的細胞毒性作用,有著重要的現實意義和臨床應用價值。本研究擬以探索這一防治策略為主要目的,建立一種適用于移植肝膽道問題研究的大鼠肝移植模型,探討經歷CPRI后移植肝膽汁主要成份的變化規(guī)律及與膽管損傷的相關性,并對磷脂轉運蛋白的表達及功能變化進行研究,為臨床上移植肝膽道并發(fā)癥的防治提供新的思路。
　　 二、方法
　　

6、 為了驗證我們的假想,本實驗設計如下:首先,建立重建肝動脈的大鼠肝移植模型,設置辛伐他汀喂飼(實驗組)、標準飼料喂養(yǎng)(對照組)和假手術組,實驗組和對照組供體肝臟經歷UW液12小時保存后植入受體,于術后14天獲取大鼠肝臟、血液及膽汁標本;隨后,應用高效液相色譜法(HPLC)檢測膽汁標本中膽鹽的成份及變化情況,并進一步分析膽汁和血清中磷脂(PL)和總膽汁酸(TBA)的變化情況,評價經過辛伐他汀處理后,移植肝大鼠的膽汁成份變化情況;然后,觀

7、察肝臟組織的病理學變化,并探討這些變化與膽汁磷脂分泌之間的關系;最后,應用免疫組織化學和實時定量PCR的方法檢測磷脂轉運蛋白的表達變化,探討辛伐他汀對大鼠移植肝磷脂變化的作用機制。
　　 三、結果
　　 1.動脈化的重建肝動脈的大鼠原位肝移植模型適合應用于膽道并發(fā)癥的研究,具有較好的操作性和可重復性;
　　 2.經辛伐他汀處理后大鼠膽汁中磷脂成份明顯增加,與假手術組和對照組相比具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);對膽

8、汁中膽鹽成份沒有影響,間接的降低了膽汁中膽鹽/磷脂的比值,減輕了這一造成移植肝膽管損傷因素的作用;
　　 3.術后辛伐他汀處理組大鼠的血清膽系酶譜(r-GT、ALP)顯著降低,有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);并且這一變化趨勢與膽汁中磷脂的分泌呈負相關;
　　 4.肝臟組織HE、Masson染色發(fā)現,對照組肝臟組織炎癥反應明顯,膽管損毀嚴重,并伴有大量的膽管增生;而辛伐他汀處理組的病理學變化則較對照組輕微;
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9、.免疫組織化學方法顯示磷脂轉運蛋白(Mdr2 P-糖蛋白)在大鼠肝細胞膜上的表達辛伐他汀處理組較對照組有明顯增強,主要位于匯管區(qū)及門靜脈周圍區(qū)域;假手術組大鼠Mdr2 P-糖蛋白僅有微弱表達;
　　 6.Taqman探針法實時定量PCR檢測Mdr2 mRNA的表達在辛伐他汀處理組大鼠中辦有顯著增強,且具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 四、結論
　　 1.辛伐他汀能有效的增加大鼠移植術后膽汁中磷脂成份的分泌,