人皮膚成纖維細胞誘導多潛能干細胞的研究.pdf

1、目的：通過異位表達某些轉(zhuǎn)錄因子，可以將體細胞重編程成誘導性多潛能干細胞(iPSCs)，它能避開ES細胞帶來的倫理問題，減少免疫排斥，給自體化干細胞基因治療的臨床應用提供了可能性，為遺傳性疾病體外研究提供了一個很好的平臺。
　　 方法：目前有多種方法可誘導獲得iPS細胞，包括利用各種病毒載體、純化的重組蛋白質(zhì)、修飾的RNA分子等。同時研究發(fā)現(xiàn)多種小分子化合物也可促進iPS的產(chǎn)生，如Vc能加速基因表達水平的改變，促進前體iPS細胞轉(zhuǎn)

2、變成完全重編程的iPS細胞；VPA在重編程過程中，可上調(diào)ES特異性基因的表達，下調(diào)MEF特異性基因的表達。
　　 在本研究中，我們利用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)將Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4這4個轉(zhuǎn)錄因子導入人皮膚成纖維細胞(HDF)，同時在誘導過程中添加Vc和VPA，最終獲得iPS細胞。然后，通過TRA-1-60/TRA-1-81活細胞染色，機械法挑取陽性克隆傳代培養(yǎng)。采取形態(tài)學、堿性磷酸酶染色以及干細胞表面多潛能標

3、志物染色的方法對傳代后的克隆進行初步鑒定。
　　 結(jié)果：(1)用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細胞，可獲得較高質(zhì)量的逆轉(zhuǎn)錄病毒；(2)誘導出的克隆在形態(tài)上與hES細胞相似，外源基因GFP不表達，經(jīng)過活細胞染色發(fā)現(xiàn)其 TRA-1-60/TRA-1-81有表達，挑取上述克隆傳代后，AP染色結(jié)果呈陽性，ES細胞表面標志免疫熒光檢測呈陽性。傳至P7代，仍然具有ES樣克隆形態(tài)。