三氧化二砷上調BNIP3和Beclin1誘導視網膜母細胞瘤自噬性死亡的研究.pdf

1、研究背景：
　　 視網膜母細胞瘤是嬰幼兒最常見的眼內惡性腫瘤，其惡性程度高，不僅對視力有極大損害，并可危及生命。在發(fā)達國家視網膜母細胞瘤患兒存活率可達百分之九十，我國絕大部分視網膜母細胞瘤患者臨床就診時往往已經到了中晚期，對于中晚期的視網膜母細胞瘤的治療臨床上目前仍以眼球摘除為當前主要治療手段。眼球摘除使患兒致殘并給患兒造成心理障礙，放射治療給患兒帶來嚴重并發(fā)癥并可造成面部畸形，在挽救患兒生命并保住視力是我們迫切期待的，因此需要

2、尋找新的有效化療方法和化療藥物，然而腫瘤細胞耐藥、逃逸凋亡導致腫瘤對多種生物化療藥物的耐受使目前腫瘤化療受到極大的限制。
　　 近年來的研究表明腫瘤細胞能夠以非凋亡途徑發(fā)生細胞死亡即自噬性細胞死亡，并有文獻報道一定程度的自噬可以增強化療療效，若能增強自噬的激活也會直接導致腫瘤細胞自噬性死亡，從而自噬作為一種新的化療手段越來越受科研工作者的關注。自噬性細胞死亡又稱Ⅱ型程序性細胞死亡是細胞通過形成自噬溶酶體，降解其所包裹的細胞器和細

3、胞內廢棄的蛋白內容物以實現細胞自身的代謝需要和細胞器的自我更新，自噬廣泛存在于真核細胞的病理生理過程中包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展和抗癌治療。正常的細胞通過清除細胞內過剩、損傷、衰老及廢棄的蛋白和細胞器維持細胞自身內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。隨著90年代自噬相關基因的陸續(xù)發(fā)現及自噬調控機制逐漸的闡明，通過調控自噬信號途徑來治療各種腫瘤，已逐漸被臨床接受并開始使用。先前曾有文獻報道使用三氧化二砷治療視網膜母細胞瘤可導致視網膜母細胞瘤細胞生長周期停滯，細胞出現凋亡

4、。最近又有臨床研究數據顯示三氧化二砷在治療急性早幼粒細胞白血病患者和多發(fā)性骨髓瘤患者時并未出現明顯毒副作用且臨床劑量濃度的三氧化二砷安全可靠有效。三氧化二砷可誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡途徑的死亡，國內外早已有報道，而臨床上使用三氧化二砷誘導腫瘤細胞通過凋亡途徑的細胞死亡為臨床服務已經十分常見。關于三氧化二砷是否可誘導視網膜母細胞瘤發(fā)生自噬并導致自噬性死亡，國內外未見報道。
　　 1.研究目的
　　 1.1研究臨床化療藥物三氧化

5、二砷能否誘導SO-Rb50細胞發(fā)生自噬及自噬的結局；
　　 1.2尋找三氧化二砷致SO-Rb50細胞發(fā)生自噬的最佳作用時間和有效濃度，研究自噬相關信號通路的基因表達，為尋找靶向于自噬分子機制的抗腫瘤藥物提供理論依據。
　　 2.實驗方法
　　 2.1用梯度濃度的As2O3處理SO-Rb50細胞，MTT法測定As2O3對SO-Rb50細胞系增殖的抑制作用；
　　 2.2構建自噬標記物pGFP-LC3轉染SO

6、-Rb50細胞，經不同濃度As2O3處理48h后行激光共聚焦顯微鏡檢測自噬激活；
　　 2.3 MDC自噬特異性染料行熒光染色檢測自噬泡，透射電鏡檢測自噬，流式細胞儀定量檢測各處理組MDC熒光顆粒陽性細胞百分比及凋亡比列；
　　 2.4 RT-PCR、Western blot檢測As2O3誘導的SO-Rb50細胞自噬死亡的相關基因轉錄激活及表達情況。
　　 3.結果
　　 3.1 As2O3對SO-Rb5

7、0細胞系的增殖有抑制作用隨給藥時間和給藥濃度的增加，抑制作用越顯著；
　　 3.2處理組和陽性對照組可見GFP-LC3綠色熒光蛋白呈點狀聚集在相應自噬泡，未處理組GFP-LC3綠色熒光蛋白彌散分布；
　　 3.3空對照組僅含10％胎牛血清培養(yǎng)基的SO-Rb50瘤細胞48h后見極少MDC陽性熒光顆粒且彌散分布；經不同濃度As2O3處理的SO-Rb50瘤細胞48h后可見明顯聚集的點狀MDC陽性熒光顆粒聚集在細胞質相應的自噬發(fā)

8、生區(qū)且MDC陽性細胞數顯著增加；同時自噬的陽性對照組Rapamycin處理的SO-Rb50瘤細胞，全視野下可見半數以上的SO-Rb50瘤細胞大量的點狀熒光顆粒聚集；
　　 3.4透射電鏡檢測見陰性對照組瘤細胞形態(tài)基本正常，未見明顯改變;As2O3處理組48h后出現大量雙層膜狀結構及自噬溶酶體，同時胞質內線粒體發(fā)生腫脹，陽性對照Rapamycin處理組同樣可見自噬溶酶體；
　　 3.5 MDC流式結果顯示As2O3處理組較

9、空對照組即10％胎牛血清培養(yǎng)組，自噬泡陽性瘤細胞百分比隨As2O3濃度遞增而增加，空對照組未見自噬泡陽性瘤細胞，自噬發(fā)生48h后隨時間的延長自噬百分比呈下降趨勢；
　　 3.6凋亡流式結果顯示凋亡在給藥早期百分比低下，而在給藥晚期則凋亡百分比明顯上升；
　　 3.7 RT-PCR見含胎牛血清培養(yǎng)基的未處理組MAPlLC3轉錄水平未見表達，處理組較陽性對照組條帶稍暗；Western Blot見處理組與未處理組72h后BNI

10、P3和Beclinl均有表達，處理組較未處理組表達量明顯增加。
　　 4.結論
　　 4.1 As2O3能明顯抑制SO-Rb50瘤細胞的生長，并可誘導SO-Rb50瘤細胞發(fā)生自噬，其機制可能與BNIP3和Beclinl基因轉錄表達上調相關;
　　 4.2 SO-Rb50瘤細胞經As2O3處理后，早期自噬發(fā)生呈明顯的濃度時間依賴性，隨著處理藥物濃度的增大自噬程度增高；4.3自噬在As2O3致SO-Rb50瘤細胞死亡