孤核受體NR4A1在胰島β細胞中的功能與調(diào)控的機制研究.pdf

1、目前，NR4A1在調(diào)節(jié)細胞凋亡中的作用尚有爭議。胰腺β細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)經(jīng)常面臨各種不利條件，如高濃度的游離脂肪酸(FFA)和持續(xù)的高血糖，而嚴重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激導致胰島β細胞凋亡。本研究的目的是分析NR4A1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的β細胞凋亡中的作用，并探索相關的機制。我們證實，用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導劑毒胡蘿卜素(TG)或棕櫚酸(PA)處理MIN6細胞和小鼠胰島可導致NR4A1的mRNA和蛋白質(zhì)水平增高。MTT結果表明在MIN6細胞中過表達NR4

2、A1能夠抵抗由TG或PA誘導的細胞損失;TUNEL實驗結果表明，NR4A1過表達也能防止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的細胞凋亡。利用siRNA敲出MIN6細胞中NR4A1的表達以及利用NR4A1敲除小鼠進一步證實了上述結論。在MIN6細胞中過表達NR4A1可降低TG或PA引起的C/ EBP同源蛋白(CHOP)的表達和Caspase3的活化。在MIN6細胞和小鼠胰島中過表達NR4A1可導致SURVIVIN表達的上調(diào)。我們證實在SURVIVIN的啟動子上

3、（-1872bp至-1866bp）有一個NR4A1的結合位點，免疫共沉淀實驗表明，NR4A1與SURVIVIN啟動子有物理結合。綜上所述，NR4A1通過上調(diào)SURVIVIN的表達和下調(diào)CHOP的表達來保護胰島β細胞免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的細胞凋亡，我們稱之為“正向的和負向的調(diào)節(jié)”。
　　第一部分 胰島β細胞中NR4A1與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的關聯(lián)
　　目的:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導劑對NR4A1的表達的影響以及NR4A1對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引起的β細胞凋亡

4、的作用。
　　方法:
　　1.用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導劑TG(0.5μM)或PA(0.4 mM)分別處理MIN6細胞，收取不同時間點樣品，提取RNA和蛋白，分別用熒光定量PCR和Western blot檢測隨TG或PA刺激時間的延長，NR4A1以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志分子CHOP在mRNA和蛋白水平的表達變化。
　　2.取16周齡的C57BL/6J小鼠，斷頸處死，提取并分離純化小鼠胰島，將所提取胰島平均分組，用0.5μM TG或0.

5、4 mM PA分別處理不同時間，提取RNA，用熒光定量PCR法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志分子BIP，CHOP以及NR4A1的表達變化。
　　3.取16周齡的C57BL/6J小鼠，斷頸處死，提取并分離純化小鼠胰島，0.5μM TG或對照溶劑DMSO分別處理6小時，收集胰島細胞，用胰島素一抗及NR4A1一抗雙染，檢測NR4A1在胰島β細胞中被誘導表達的情況。
　　4.用過表達NR4A1的慢病毒感染MIN6細胞，建立穩(wěn)定過表達NR4A1的

6、MIN6細胞克隆，用0.5μM TG或0.4 mM PA分別處理不同時間，用MTT方法檢測細胞的存活率;用0.5μM TG或0.4 mM PA處理過表達NR4A1的MIN6細胞及對照細胞24小時，用TUNEL法檢測細胞凋亡比率。
　　結果:
　　1.用0.5μM TG處理MIN6細胞后，可誘導NR4A1表達升高，其mRNA水平在1小時即有明顯升高，2小時達到最高峰，其蛋白水平則逐漸升高，CHOP也明顯升高，說明0.5μM T

7、G成功誘導了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的發(fā)生;用0.4 mM PA處理MIN6細胞也可誘導NR4A1表達升高，在16小時達到高峰，同時CHOP也明顯升高。
　　2.分離純化小鼠胰島后，用0.5μM TG處理后，NR4A1的mRNA在0.5 h即有明顯升高，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志分子BIP和CHOP也明顯升高;用0.4 mM PA處理后，NR4A1在6小時即有明顯升高，CHOP也顯著升高。
　　3.0.5μMTG能誘導NR4A1表達升高（綠色），而D

8、MSO并不能誘導NR4A1表達升高，并且NR4A1大部分與胰島素（紅色）共定位。
　　4.成功建立穩(wěn)定過表達NR4A1的MIN6細胞株，過表達NR4A1的細胞稱為OV細胞，對照細胞稱為NC細胞。MTT結果顯示，用0.5μM TG或0.4 mM PA處理后，OV細胞的存活率明顯高于NC細胞;TUNEL結果也顯示，TG或PA處理后NC細胞的凋亡陽性率明顯高于OV細胞。
　　結論:
　　1.無論在MIN6細胞還是小鼠胰島β細

9、胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導劑TG和PA均可誘導NR4A1表達升高。
　　2.過表達NR4A1可抵抗TG和PA引起的β細胞的凋亡，而沉默或敲除NR4A1后TG和PA更易導致細胞凋亡。
　　第二部分 NR4A1對UPR反應中各通路的影響
　　目的:研究NR4A1是通過影響UPR反應中的哪一條信號途徑來抵抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引起的凋亡。
　　方法:
　　1.用0.5μM TG處理穩(wěn)定過表達NR4A1的MIN6細胞以及對照細胞，

10、收集不同時間點的細胞樣品，提取RNA，用熒光定量PCR法檢測IRE1通路中sXBP1與tXBP1的比值變化，PERK通路中ATF4的表達變化以及ATF6通路中ATF6的表達變化。
　　2.用0.5μM TG處理穩(wěn)定過表達NR4A1的MIN6細胞以及對照細胞，收集不同時間點的細胞樣品，提取RNA和蛋白，分別以熒光定量PCR和western blot檢測PERK通路中CHOP，eif2α以及其磷酸化形式(P-eif2α)的表達變化。<

11、br>　　結果:
　　1.0.5μM TG處理后，NC和OV細胞在3小時就都發(fā)生了XBP1的剪切，但NC和OV細胞中的sXBP1/tXBP1并沒有明顯差異;而PERK通路中的ATF4在TG處理后都有所提高，但在OV細胞中提高的幅度明顯低于NC細胞;而ATF6在兩組細胞中也無明顯差異。
　　2.0.5μMTG處理后，NC和OV細胞中的CHOP在mRNA和蛋白水平上均有明顯升高，但是在OV細胞的表達要明顯低于NC細胞;在TG的作

12、用下，eif2α在兩種細胞中并無明顯區(qū)別，在NC細胞中eif2α持續(xù)磷酸化，而在OV細胞中從12小時開始，磷酸化的eif2α發(fā)生去磷酸化。
　　結論:
　　1.NR4A1對UPR反應中IRE1和ATF6通路無明顯影響，但可以通過改變PERK通路中的相應分子的變化來抵抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。
　　2.過表達NR4A1可以使P-eif2α發(fā)生去磷酸化，推測NR4A1可能通過改變GADD34來影響eif2α的磷酸化。
　　第三部

13、分 NR4A1對抗凋亡基因的影響
　　目的:研究在胰島β細胞中NR4A1能夠調(diào)控哪些抗凋亡基因的表達來抵抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引起的細胞凋亡。
　　內(nèi)容:
　　1.提取過表達NR4A1的MIN6細胞及對照細胞的RNA和蛋白，熒光定量PCR和westernblot檢測NC及OV細胞中抗凋亡相關基因NF-κB，BCL-2，SURVIVIN的表達差異。
　　2.用過表達NR4A1的腺病毒及對照病毒感染MIN6細胞48小時，收集蛋

14、白樣品，westernblot檢測NF-κB，BCL-2，SURVIVIN在蛋白水平上的差異表達。
　　3.取16周齡的C57BL/6J小鼠，斷頸處死，提取并分離純化小鼠胰島，用過表達NR4A1的腺病毒及對照腺病毒瞬時感染48小時，提取RNA，以熒光定量PCR檢測NF-κB，BCL-2，SURVIVIN在RNA水平的差異表達。
　　結果:
　　1.在OV細胞中，NF-κB，BCL-2，SURVIVIN在RNA和蛋白水平

15、上的表達都明顯高于NC細胞。
　　2.Ad-NR4A1感染的MIN6細胞中，NR4A1和SURVIVIN的表達都明顯高于Ad-GFP感染的MIN6細胞。
　　3.Ad-NR4A1感染的小鼠胰島細胞中，NF-κB，BCL-2，SURVIVIN在RNA水平上的表達都明顯高于對照細胞。
　　結論:
　　NR4A1能夠調(diào)控抗凋亡基因SURVIVIN，NF-κB及BCL-2的表達，且對SURVIVIN的調(diào)控是直接的，而對N