EBV相關淋巴瘤動物模型的差異表達基因篩選.pdf

1、目的：檢測分析Scid小鼠體內EBV相關淋巴瘤和正常人淋巴細胞兩者宿主細胞的差異表達基因，篩選EBV誘發(fā)淋巴瘤的候選關鍵基因，探討EBV相關淋巴瘤發(fā)生的可能分子機制。
　　方法：采集健康獻血員新鮮血液樣本，分離出人淋巴細胞，分別保存正常淋巴細胞，復制 Scid小鼠體內 EBV相關淋巴瘤模型。采用4×44K的Agilent人類全基因組表達譜芯片進行檢測，分析Scid小鼠體內EBV相關淋巴瘤和正常人淋巴細胞的差異表達基因，篩選出fol

2、d change≥2的基因為表達顯著上調基因，F(xiàn)old change≤0.5為表達顯著下調基因。運用GO分類、KEGG代謝通路、Biocarta和Reactom調控通路及DAVID在線軟件對差異基因進行功能聚類及通路分析，并結合STRING、Cytscape分析差異基因的相互作用，預測差異基因的生物學功能。
　　結果：
　　1、病理學診斷Scid小鼠體內誘發(fā)腫瘤為彌漫大B細胞淋巴瘤，且PCR證實此淋巴瘤為人源性，成功復制體內

3、EBV相關淋巴瘤實驗模型。6例樣本標準化數(shù)據均采用LIMMA、BRB-Random Variance Model、SAM軟件篩選差異表達基因，以PDR<0.001共篩選出差異表達探針3928個。將未映射到HUGO的Probe剔除，再選取fold-change2倍變化視為表達差異顯著，共篩選出202個差異表達基因，其中上調基因44個，下調基因158個，系統(tǒng)構建了6例同源EBV相關淋巴瘤（T）和正常淋巴細胞（N）的差異基因表達譜。
　

4、　2．差異表達基因的生物信息學分析
　　Gene Ontology分類的BP分析顯示，共30個上調基因參與27個BP分類，其中與細胞周期和有絲分裂相關的“cell cycle”,“cell cycle phase”,“nuclear division”,“mitosis”,“M phase of mitotic cell cycle”,“cell cycle process”,“organelle fission”,“M phas

5、e”和“mitotic cell cycle”等10個GO BP分類的EASE score最低，均<2.6E-09。上調基因CDC6, KIFC1, OIP5, NCAPG, KIF15, BUB1, CDCA2, AURKA, CEP55, PBK參與多個與細胞周期相關的生物過程。126個下調基因參與116個BP分類，其中“inflammatory response”,“response to wounding”,“immune re

6、sponse”,“defense response”,“taxis”,“chemotaxis”,“regulation of secretion”,“behavior”,“anti-apoptosis”和“protein kinase cascade”的EASE Score得分最低，均<1.6E-04。下調基因CSF2, CCL2, CXCL5, CXCL2, TLR2, FCN1, LILRA5, IL1RAP, IL1B, THBS

7、1, CFD, PTX3, FCGR3A, IL1A, IL1RN等主要與細胞損傷、炎癥反應、免疫應答等生物學過程相關。
　　25個上調基因參與13個MF分類，其中主要涉及核酸結合活性，如“ATP binding”,“adenyl ribonucleotide binding”,“adenyl nucleotide binding”,“purine nucleoside binding”和“nucleoside binding”的

8、EASE Score得分最低，均<0.006。參與多個分子功能的基因有 CDC6, KIFC1, KIF15, BUB1, AURKA, PBK,TOP2A, GSG2, RAD51。123個下調基因參與12個MF分類，其中主要涉及分子信號與細胞因子受體結合，如“carbohydrate binding”,“cytokine binding”,“polysaccharide binding”,“protein binding”和“gly

9、cosaminoglycan binding”,“cytokine activity”,“interleukin-1 receptor binding”的EASE Score的得分最低，均<0.001。參與多種分子功能的基因有SELP, TNFAIP6, CCL2, C6ORF25, TLR2, PTX3, THBS1, NLRP3, IL1RN, IL1B, IL1A。
　　利用“KEGG Pathway”,“BioCarta”

10、和“Reactome”進行Pathway分析顯示，當EASE Score<0.05時，上調基因中不參與“KEGG-pathway”，2個基因參與1條“BioCarta-pathway”，5個基因參與1條“Reactome-pathway”；下調基因中64個基因參與7條“KEGG-pathway”，30個基因參與1條“BioCarta-pathway”，33個基因參與2條“Reactome-pathway”。
　　將上調和下調差異表

11、達基因涉及的生物學功能進行“Functional Annotation Clustering”分析，結果顯示上調基因涉及的生物學功能分類聚成15個集合，其中富集分數(shù)最高的功能集合主要涉及細胞周期和細胞分裂；下調基因涉及的生物學功能分類聚成63個集合，富集分數(shù)最高的功能集合主要涉及細胞趨向性、細胞成分及蛋白、多糖結合活性。
　　利用STRING、Cytoscape、PATHWAY及GO分類等生物信息學軟件綜合分析202個差異表達基因

12、（上調44個，下調158個），對此202個基因進行生物學功能分析及預測，上調基因CDC6, KIFC1, OIP5, NCAPG, KIF15, BUB1, CDCA2, AURKA, CEP55, PBK等主要參與細胞周期、有絲分裂等生物學過程；上調基因TNFRSF13B, TNFRSF17, CXCL9，下調基因CSF2, CCL2, FOS, EGF, IL1A, IL1B, DUSP6等則與腫瘤相關信號通路密切相關，如Infla

13、mmation，Angiogenesis，MAPK signal pathway，Adherens junction，NOD-like receptor signaling pathway等；下調基因CSF2, CCL2, CXCL5, CXCL2, TLR2, FCN1, LILRA5, IL1RAP, IL1B, THBS1, CFD、PTX3, FCGR3A, IL1A, IL1RN等主要與細胞損傷、炎癥反應、免疫應答等生物學過程

14、相關，如“response to wounding”,“inflammatory response”,“immune response”。本實驗結合上述多種生物信息學分析結果顯示，15個差異表達基因在蛋白網絡中處于中心位置，包括EGF, IL1B, PBK, CSF2, TLR2, DUSP6, HDC, CD68, TREM1, IL1A, CCL2, SPI1, PLAU, TGFB1和FOS，其中EGF, IL1B, PBK, C

15、SF2, TLR2這5個基因在度數(shù)和介度中的排名均靠前，我們推測EGF, IL1B, PBK, CSF2和TLR2可能是導致EBV相關淋巴瘤發(fā)生的關鍵分子。
　　3.綜合信號通路、基因生物學分類、基因間相互作用分析及已有文獻報道，提示EBV可能上調宿主細胞PBK基因促進細胞增殖，下調宿主細胞EGF基因發(fā)揮抗凋亡作用，下調宿主細胞IL1β, CSF2, TLR2基因等降低細胞免疫能力，從而導致EBV相關淋巴瘤的發(fā)生。
　　結論