小尾寒羊ANKRD2基因的克隆、結(jié)構(gòu)特征與表達(dá)分析.pdf

1、錨定重復(fù)蛋白（muscle specific ankyrin repeat proteins-MARPs）家族是由三個(gè)保守的成員組成：心肌錨定重復(fù)蛋白（Ankyin repeat domain1，ANKRD1）、骨骼肌錨定重復(fù)蛋白（Ankyin repeat domain2，ANKRD2）和錨定重復(fù)蛋白23（Ankyin repeat domain23，ANKRD23）。本試驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期小尾寒羊和杜泊羊臂二頭肌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，對(duì)兩個(gè)

2、轉(zhuǎn)錄本差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，挖掘到差異表達(dá)基因ANKRD2為本研究的目的基因。ANKRD2基因特異性表達(dá)于骨骼肌，在骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育過程中起重要作用，參與肌細(xì)胞的分化與肌纖維的形成和成熟。目前關(guān)于小尾寒羊ANKRD2的核酸序列、分子結(jié)構(gòu)和組織表達(dá)尚未見報(bào)道。本研究克隆了小尾寒羊ANKRD2基因的全長(zhǎng)cDNA序列并對(duì)其編碼的蛋白進(jìn)行了一系列的生物信息學(xué)分析，在mRNA水平和蛋白水平上對(duì)小尾寒羊和杜泊羊的組織表達(dá)進(jìn)行了分析。主要研究結(jié)果如下：

3、
　　(1)小尾寒羊ANKRD2基因全長(zhǎng)cDNA序列的克隆使用RT-PCR,5′ RACE和3′RACE法，其全長(zhǎng)1179 bp,包含990 bp的開放閱讀框、21bp的5′非編碼區(qū)(5′UTR)和168 bp的3′非編碼區(qū)(3′ UTR)。其中，開放閱讀框編碼329個(gè)氨基酸的多肽鏈。我們克隆該基因并將其提交在Genbank上，登陸號(hào)是KR090892。在NCBI上下載該基因的預(yù)測(cè)序列，與我們克隆的序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)相似率約99.

4、40％，CDS區(qū)存在2個(gè)堿基突變位點(diǎn)。
　　(2)生物信息學(xué)分析顯示，ANKRD2基因編碼的蛋白分子量為36.7 kDa，脂溶指數(shù)為87.48（＞60），蛋白的流動(dòng)性較大。不穩(wěn)定指數(shù)為49.57（＞40），蛋白的穩(wěn)定性一般。疏水性指數(shù)為-0.6，說明它為水溶性蛋白，且親水性較好。等電點(diǎn)為5.72，為偏酸性蛋白，氨基酸組分最多的是谷氨酸。預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是α螺旋和無規(guī)則卷曲。生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)其C值、S值和Y值均小于0.5，

5、推斷其不含有蛋白信號(hào)肽，屬于非跨膜蛋白，故不能被分泌到細(xì)胞外發(fā)揮作用。在氨基酸序列中，發(fā)現(xiàn)14個(gè)磷酸化位點(diǎn)，12個(gè)泛素化位點(diǎn)，10個(gè)糖基化位點(diǎn)，4個(gè)錨定重復(fù)結(jié)構(gòu)域。利用Swiss-model軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)模型ANK-N5C-317（4o60.1.A）與我們所研究的蛋白擁有最相似的三級(jí)結(jié)構(gòu)。
　　(3)將獲得的小尾寒羊該基因編碼的氨基酸序列與其他物種的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)小尾寒羊ANKRD2氨基酸與所選物種的相似性均在86%

6、以上，說明該蛋白在哺乳動(dòng)物中高度保守，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)綿羊的遺傳距離與山羊、牛、馬相距較近，與人類、豬、鼠、虎鯨的遺傳距離相距較遠(yuǎn)。
　　(4)通過熒光定量 PCR和Western-blot技術(shù)分析該基因在小尾寒羊和杜泊羊不同的組織間的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)該基因在小尾寒羊和杜泊羊中均呈現(xiàn)出組織表達(dá)差異性。研究發(fā)現(xiàn)該基因主要在小尾寒羊和杜泊羊的骨骼肌中表達(dá)，在骨骼肌中的表達(dá)量最高，顯著高于其他組織（p<0.05）。此外，在骨骼肌組織中，