HP450基因的克隆及其真核表達載體pEGFP-HP450的構建和表達的研究.pdf

1、目的：
　　運用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）從正常大鼠肝組織擴增出HP450基因，以pEGFP-N1質粒為載體，構建pEGFP-HP450真核共表達載體，并通過脂質體介導轉染大鼠肝癌細胞株CBRH7919，觀察其表達，以獲得能夠穩(wěn)定表達HP450基因且具有綠色熒光的大鼠肝癌細胞株CBRH7919，從而為HP450基因對肝癌影響的藥理學研究提供實驗依據。
　　方法：
　　1.真核共表達載體pEGFP-HP450的

2、構建：用Trizol試劑從正常大鼠肝組織中提取總RNA，用RT-PCR技術擴增HP450基因，并克隆到經EcoRI、BamHI雙酶切過的puc19載體，經藍白篩選及PCR、酶切和測序鑒定得到陽性克隆。再用EcoRI、BamHI內切酶將HP450基因從質粒上切取、膠回收純化后，與 EcoRI、BamHI雙酶切過的pEGFP-N1真核表達質粒連接，構建的pEGFP-HP450真核共表達載體經PCR、酶切和測序鑒定。
　　2. pEGF

3、P-HP450轉染大鼠肝癌細胞株CBRH7919：應用脂質體轉染技術，用重組質粒pEGFP-HP450轉染CBRH7919細胞，24 h后在熒光倒臵顯微鏡下觀察融合基因的表達情況。G418篩選出能穩(wěn)定表達融合基因的陽性單克隆細胞株，用RT-PCR在mRNA水平檢測HP450基因的表達。
　　結果：
　　1．通過RT-PCR擴增獲得HP450目的基因片段（1477）。
　　2．成功構建了 puc19-HP450重組載體，

4、HP450基因的測序結果與GenBank公布的一致。
　　3．成功構建了 pEGFP-HP450真核共表達載體，經 PCR和EcoRI、BamHI雙酶切鑒定其目的片段大小與預期的一致。
　　4．建立了穩(wěn)定表達 HP450的CBRH7919細胞系，經熒光顯微鏡觀察，轉染24 h后細胞內發(fā)出綠色熒光；用RT-PCR在mRNA水平檢測HP450基因的表達，其大小與預期的一致。
　　結論：
　　1.本研究成功構建了HP4