大豆脂肪氧化酶基因RNAi表達載體的構建及表達調控的研究.pdf

1、本項研究應用基因工程手段，克隆大豆脂肪氧化酶基因核心保守序列，構建高效的具有hpRNA和ihpRNA結構的大豆脂肪氧化酶基因RNAi表達載體。通過花粉管通道法將其導入大豆，抑制大豆脂肪氧化酶基因的表達，調控脂肪氧化酶的生物合成過程。以期通過基因工程手段，改變大豆脂肪氧化酶合成途徑，降低大豆脂肪氧化酶含量，提高大豆油份含量，培育具有優(yōu)良品質的大豆品種。取得如下結果： 1.改造植物表達載體pCAMBIA1301，去除其臂內潮酶素基因

2、，并在臂內按逆時針方向添加一個從質粒pBI121上酶切下來的35S啟動子。 2.以大豆品種“吉農18號”的基因組DNA為模板，選取大豆三種脂肪氧化酶同功酶基因同源性最高部分，通過PCR擴增得到大豆脂肪氧化酶基因片段，將其克隆到pMD18-Tvector載體上，測序結果表明：克隆片段大小為357bp。對比NCBI基因Bank，與已發(fā)表的基因一致。將大豆脂肪氧化酶基因片段按正向+反向的順序插入到pCAMBIA130135S啟動子下，

3、構建大豆脂肪氧化酶基因hpRNA干擾表達載體pC1301LoxRi。通過花粉管通道法轉化大豆品種“吉農18號”，獲得T0代轉化籽粒，萌發(fā)后以單棵植株葉片的總DNA為模板，以pCAMBIA1301臂內GUS基因設計一對引物進行PCR擴增，結果從6棵植株中擴增得到720bp的特異帶，回收該條帶連接于pMD18-Tvector載體并測序，結果顯示其為要擴增的GUS基因片段。為進一步確定外源基因的整合情況，從PCR陽性植株中隨機抽取2株進行So

4、uthern blot分析。結果表明，轉化株均有雜交帶出現(xiàn)，外源基因以單拷貝和雙拷貝的形式插入，而未經轉化的植株沒有雜交信號出現(xiàn)，證明外源基因已整合到大豆基因組中。以轉基因大豆籽粒的總RNA反轉錄成的cDNA為模板做RT-PCR，從電泳條帶的亮度上看，轉基因植株和非轉基因植株的內標18SRNA含量相同，而內源脂肪氧化酶mRNA的含量明顯降低。 3.克隆了大豆“吉農18號”自身的一段內含子，片段長度230bp，將其插入到表達載體p

5、C1301LoxRi的正義基因片段和反義基因片段中間，構建大豆脂肪氧化酶基因ihpRNA干擾表達載體pC1301LoxiRi。通過花粉管通道法轉化大豆品種“吉農18號”，獲得T0代轉化籽粒，萌發(fā)后以單棵植株葉片的總DNA為模板，以pCAMBIA1301臂內T-DNA區(qū)GUS基因設計一對引物進行PCR擴增，結果從18棵植株中擴增得到720bp的特異帶，回收該條帶連接于pMD18-Tvector載體并測序，結果顯示其為要擴增的GUS基因片段

6、。為進一步確定外源基因的整合情況，從PCR陽性植株中隨機抽取3株進行Southern blot分析。結果表明，轉化株均有雜交帶出現(xiàn)，外源基因以單拷貝和雙拷貝的形式插入，而未經轉化的植株沒有雜交信號出現(xiàn)，證明外源基因已整合到大豆基因組中。以轉基因大豆籽粒的總RNA反轉錄成的cDNA為模板做RT-PCR，從電泳條帶的亮度上看，轉基因植株和非轉基因植株的內標18SRNA含量相同，而內源脂肪氧化酶mRNA的含量明顯降低。 4.以T1代轉

7、化的籽粒為材料，采用紫外分光光度法對脂肪氧化酶活性進行了測定，結果顯示，轉pC1301LoxRi質粒大豆的脂肪氧化酶活性分別為降低62％，轉化pC1301LoxiRi質粒大豆的脂肪氧化酶活性減低74％。說明外源基因的導入有效地抑制了脂肪氧化酶基因的表達。 5.以T1代轉化的籽粒為材料，采用SDS-PAGE電泳，結果顯示轉化pC1301LoxRi質粒大豆的脂肪氧化酶含量比對照平均降低55％，轉化pC1301LoxiRi質粒大豆的脂

8、肪氧化酶含量比對照平均降低71％。 6.以T1代轉化的籽粒為材料，轉基因植株蛋白質的凱氏定氮和索氏提取測定結果顯示，轉基因植株蛋白質含量均有所下降，脂肪含量均有所上升：其中轉化pC1301LoxRi質粒植株蛋白質含量平均為36.06％，比非轉基因對照降低0.95個百分點(非轉基因蛋白質含量37.01％)，最大降低1.28百分點達到35.73％，脂肪平均含量23.89％，比非轉基因對照平均提高了0.74個百分點(非轉基因脂肪含量2

9、3.15％)，最大提高1.09個百分點，達到24.24％；轉pC1301LoxiRi質粒植株蛋白質含量平均為35.63％，比非轉基因植株對照降低了1.38個百分點(非轉基因蛋白質含量37.01％)，最大降低1.62百分點達到35.39％，脂肪平均含量24.33％，比非轉基因對照平均提高了1.18個百分點(非轉基因脂肪含量23.15％)，最大提高1.61個百分點，達到24.76％。 7.觀察T1代轉化植株的主要農藝形狀，包括：株高

10、、節(jié)數、結莢數、單株粒數、蟲食粒、百粒重，發(fā)現(xiàn)轉基因植株與非轉基因對照無明顯差別。 8.對轉基因植株T2代的PCR分析及PCR-Southern結果證明：外源基因在轉基因后代中能遺傳。其分離比基本符合孟德爾的遺傳規(guī)律。 9.探討了應用重組PCR構建植物基因RNA干擾構件，初步證明其是一種簡便、快捷、可行、適用范圍廣的方法。 10.初步探討了大豆花粉管通道法的室內轉化條件，證明在我國北方地區(qū)采用花粉管通道法轉化大豆

11、可以在室內進行，每年可以加代一次。 本項研究首次將RNA干擾技術應用于改良大豆脂肪氧化酶含量，取得了良好效果，獲得了脂肪氧化酶含量明顯降低，脂肪含量明顯提高的轉基因大豆植株，突破了傳統(tǒng)育種方法在改良大豆品質方面易受種質資源限制和育種時間長的缺點，為應用RNA干擾技術改良大豆品質提高大豆油份含量探索了新的途徑，實現(xiàn)了大豆品質改良育種和高油育種的方法創(chuàng)新，也為以后通過RNA干擾技術改良大豆其它營養(yǎng)抑制因子，提高大豆品質奠定了基礎，具