結直腸癌患者外周血中抗survivin抗體與survivin mRNA表達及臨床意義.pdf

1、目的:結直腸癌(CRC)是最常見的消化道腫瘤之一,由于早期診斷率低,術后易復發(fā)或轉移,其仍是一種具有高侵襲性、高病死率的惡性腫瘤。結直腸癌的早期診斷及復發(fā)或轉移的監(jiān)測是目前亟待解決的問題,尋找方便有效的標志物顯得尤為重要。本研究的目的就是探討結直腸癌患者外周血中抗survivin抗體及survivin mRNA的表達情況及其臨床意義,為結直腸癌的診治提供更多的生物學標志物。
　　方法:選擇CRC患者116例,依據(jù)所接受治療手段,分

2、為根治手術組、姑息手術組、姑息化療組。對照組為30例健康體檢者。根治手術組和姑息手術組分別于手術前1天、術后第4周末清晨空腹采集外周血5ml,其中根治手術組每3個月隨訪一次,抽外周血5ml;姑息化療組于化療前及化療2周期后采集外周血5ml;對照組清晨空腹采集外周血5ml。所采集血液標本中,其中2ml使用無抗凝劑的真空管采集,以3000r/min,離心10min,取上清液,凍存于-20℃冰箱,用于檢測抗survivin抗體;剩余3ml使用

3、含有乙二胺四乙酸抗凝劑的真空管采集,采集后室溫靜置半小時,然后提取總 RNA,用于檢測survivin mRNA。應用雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附法測定血清中抗survivin抗體的水平。向預先包被人存活素抗體的酶標孔中加入標準品、待測樣本和辣根過氧化物酶標記的存活素抗體,經(jīng)過溫育和洗滌,去除未結合的組分,然后依次加入底物A、B,產(chǎn)生藍色,并在酸的作用下轉化成為最終的黃色。顏色的深淺與樣品中抗survivin抗體的濃度呈正相關。通過測定標準品

4、得到標準曲線方程,依據(jù)標準方程計算抗survivin抗體濃度。應用半定量RT-PCR法測定外周血中survivin mRNA相對表達水平。首先提取外周血中總RNA,檢測其純度和完整性后,進行反轉錄。反應體系包括5×Buffer2μl,RT Enzyme MixΙ0.5μl,Oligo dT Primer(50M)0.5μl,Random6 mers(100M)0.5μl, Total RNA500ng,,RNase Free dH2O補

5、至10μl。反轉錄條件為37℃,15min,85℃,5s。選取β-actin作內參基因,應用Primer Premier5.0軟件設計引物。 Survivin mRNA上下游引物分別為5′-GTCCCTGGCTCCTCTACTG-3′,5′-GACGCTTCCTATCACTCTATTC-3′,產(chǎn)物大小為174bp;β-actin上下游引物分別為5′-AGAGCCTCGCCTTTGCCGAT-3′,5′-TGCCAGATTTTCTCCAT

6、GTCGT-3′,產(chǎn)物大小為313bp。25μlPCR反應體系包含Premix Ex Taq(2×)12.5μl,上游引物0.5μl,下游引物0.5μl,DNA模板2μl,滅菌蒸餾水9.5μl。經(jīng)過預變性95℃,30s,34個循環(huán)(變性95℃,5s,退火60℃,30s,延伸72℃,50s),終延伸72℃,2min,其中survivin循環(huán)數(shù)為34,退火溫度60℃,β-actin循環(huán)數(shù)為28,退火溫度62℃。所得產(chǎn)物進行2.5％瓊脂糖電泳

7、鑒定,并應用培清凝膠成像分析系統(tǒng),分別測定β-actin和 survivin條帶的光密度值,并計算survivin的表達系數(shù),即survivin的光密度值與β-actin的光密度值之比。應用SPSS18.0軟件包進行統(tǒng)計學分析,計量資料采用t檢驗或方差分析,計數(shù)資料采用卡方檢驗,P<0.05為差異有顯著性。
　　結果:1. CRC患者與健康者外周血中抗survivin抗體陽性率分別為40.5%和0,survivin mRNA陽性率

8、分別為76.7%和0,均有顯著差異(P=0.000)。
　　2. CRC患者外周血中抗survivin抗體及Survivin mRNA的表達與患者年齡、性別、腫瘤類型、組織學分型無關,而與分期、腫瘤大小及淋巴結是否轉移顯著相關。抗 survivin抗體表達水平及 survivin mRNA陽性率隨著腫瘤分期的增高而增高;腫瘤直徑>5cm者二者表達水平較腫瘤直徑≤5cm者高,差異具有顯著性( P=0.045, P=0.003);有淋

9、巴結轉移者抗survivin抗體水平及survivin mRNA陽性率較無淋巴結轉移者顯著增高(P=0.040,P=0.000)。
　　3.74例CRC患者行根治性手術,術后血清中抗survivin抗體水平及survivin mRNA表達較術前明顯降低(P=0.005,P=0.004);隨訪過程中出現(xiàn)復發(fā)或者轉移共13例,復發(fā)或轉移患者外周血中二者表達水平均較前顯著升高(P=0.024,P=0.048)。此外,復發(fā)或轉移者根治術后

10、二者表達水平顯著高于無復發(fā)或轉移者(P=0.001, P=0.004)。14例患者行姑息手術,手術前后抗survivin抗體和survivin mRNA表達水平無顯著差異(P=0.709,P=0.669)。
　　4.在行姑息性化療的患者中,有效組抗 survivin抗體和 survivin mRNA表達水平化療后較化療前明顯降低(P=0.043,P=0.032);無效組抗 survivin抗體水平化療前后變化無顯著性( P=0.1

11、35),而survivin mRNA表達水平化療后較化療前顯著升高(P=0.039);二者水平均低者較高者對化療更敏感(P=0.001,P=0.006)。
　　結論:
　　1.抗survivin抗體和survivin mRNA在CRC患者外周血中表達較高,可能是監(jiān)測結直腸癌的發(fā)病指標之一。
　　2.抗survivin抗體和survivin mRNA與腫瘤負荷、腫瘤分期及淋巴結轉移具有相關性,或可作為預后判定的指標之一。

12、
　　3.外周血中 Survivin可能是監(jiān)測腫瘤微轉移及判斷腫瘤預后的指標之一。在根治術后檢測抗survivin抗體和survivin mRNA水平可對發(fā)生轉移或復發(fā)進行預測;在隨訪過程中定期檢測有抗survivin抗體和survivin mRNA水平,可監(jiān)測是否發(fā)生轉移或復發(fā)。
　　4.姑息化療前抗survivin抗體和survivin mRNA表達水平或可以作為姑息化療敏感性篩查的指標之一;姑息化療前后二者水平變化,可