EWS-FLI1介導白喉毒素表達對尤文肉瘤移植瘤殺傷作用研究.pdf

1、目的:白喉毒素A片段(DTA)對細胞有強烈的毒性,將DTA與不同的載體結(jié)合,對細胞可產(chǎn)生選擇性殺傷作用.95﹪以上的尤文肉瘤家族(EFT)存在t(11;22)(q24;q12)染色體易位,形成EWS-FLI1融合基因,新的融合基因可識別、結(jié)合一段特異基因序列(ACCGGAAGT),并促進這段基因序列下游基因的高表達.該實驗利用這一特點,觀察EWS-FLII1介導的白喉毒素A鏈基因在裸鼠背部皮下移植瘤內(nèi)的表達情況及其對腫瘤組織的殺傷作用.

2、方法:1、用尤文肉瘤細胞系(SK-ES-1)于裸鼠背部皮下種植,建立實驗用裸鼠尤文肉瘤皮下移植瘤模型.2、通過尾靜脈注射脂質(zhì)體與質(zhì)粒混合物,將含有EWS-FLI1基因結(jié)合序列ACCGGAAGT及白喉毒素A鏈基因的真核表達載體pS2-DTA轉(zhuǎn)染到裸鼠背部皮下的尤文肉瘤移植瘤內(nèi).3、觀察腫瘤體積治療前后變化,評價pS2-DTA對腫瘤的抑制作用;用組織病理切片光鏡下觀察腫瘤及心肌、肝組織細胞在治療前后的形態(tài)學改變;免疫組織化學及RT-PCR檢

3、測白喉毒素A鏈基因表達;原位細胞凋亡檢測,觀察EWS-FLI1介導的白喉毒素A鏈基因表達后,腫瘤細胞的凋亡情況.結(jié)果:1、成功復制了尤文肉瘤裸鼠背部皮下移植瘤模型.2、治療后RT-PCR檢測證實,mRNA水平,pS2-DTA在腫瘤內(nèi)可產(chǎn)生陽性表達,肝組織RT-PCR有弱陽性表達,其表達強度顯著低于腫瘤組織(P<0.05) ,治療組心肌組織RT-PCR結(jié)果呈陰性.3、心肌、肝組織免疫組織化學檢測未見有陽性結(jié)果,腫瘤組織細胞胞漿內(nèi)可見陽性棕

4、黃色染色(SP法),靠近細胞核處染色略深.4、治療組裸鼠經(jīng)治療,移植瘤體積顯著小于對照組(P<0.01).5、病理切片光鏡觀察:理鹽水組與脂質(zhì)體組腫瘤病理切片見腫瘤細胞排列緊密,細胞核較大,居中,可見核分裂像,腫瘤細胞空泡形成少.而治療組腫瘤組織中,腫瘤細胞排列疏松,可見有單個細胞與周圍細胞分離現(xiàn)象,分離出的腫瘤細胞呈小圓形,胞漿含量少,染色深,細胞與細胞核同時明顯縮小,核深染尤為顯著.大多數(shù)受損傷腫瘤細胞表現(xiàn)為細胞腫脹,體積增大,腫脹

5、的細胞內(nèi)有較多空泡形成,細胞核縮小,著色深,細胞核偏向于細胞膜一側(cè).部分腫脹細胞的細胞核消失,形成空泡狀結(jié)構.6、細胞原位凋亡檢測(TUNEL法)發(fā)現(xiàn),治療組腫瘤細胞凋亡數(shù)明顯多于自身的肝、心肌組織,腫瘤細胞凋亡指數(shù)顯著高于肝、心肌組織(P<0.01).結(jié)論:1、EWS-FLI1介導的白喉毒A鏈基因經(jīng)尾靜脈注入可在裸鼠皮下移植尤文肉瘤內(nèi)產(chǎn)生特異表達.2、EWS-FLI1介導的白喉毒A鏈基因?qū)β闶笃は掠任娜饬鲆浦擦鲇忻黠@的抑制、殺傷作用,