CKS1B基因促進多發(fā)性骨髓瘤細胞增殖與病程惡化的SKP2-P27非依賴性機制研究.pdf

1、本文為了進一步闡述CKS1B影響多發(fā)性骨髓瘤細胞生存和增殖的分子機制，以及研究CKS1B在多發(fā)性骨髓瘤疾病預后中所起的作用，進行了如下研究，并取得了相應的結果：
　　 1.CKS1B在多發(fā)性骨髓瘤病人中表達水平增高，并隨病情進展而升高
　　 本文用骨髓瘤病人骨髓中腫瘤細胞mRNA做基因芯片分析，比較了51個病人從剛確診到復發(fā)后的CKS1B表達水平的變化，Kaplan-Meier生存曲線分析結果顯示，在以初診-復發(fā)配對比較

2、的51位病人中，和那些從初診斷到復發(fā)CKS1B表達水平沒有明顯增高的病人相比，增高1.5倍以上的36位病人復發(fā)后4年的生存率顯著性的低。證實了CKS1B在多發(fā)性骨髓瘤的診斷階段是個診斷指標，并且也是個預示病人預后不良的指標。
　　 2.CKS1B基因過表達表達促進骨髓瘤細胞的增殖并提高細胞的耐藥性
　　 利用lentenvirus病毒系統(tǒng)轉染骨髓瘤細胞，建立了CKS1B過表達的細胞系。細胞分別在含1％、5％、10％胎牛血

3、清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，與轉染空白載體的對照組細胞相比，CKS1B高表達的骨髓瘤細胞表現(xiàn)出更高的增殖率,實驗證明，CKS1B能促進骨髓瘤細胞的增殖。證明了CKS1B高表達誘發(fā)了骨髓瘤細胞對多種抗腫瘤藥物耐藥。
　　 3.CKS1B基因通過SKP2-p27依賴和非依賴性途徑影響骨髓瘤細胞生長和生存
　　 本課題組為了研究CKS1B基因促進骨髓瘤生長和疾病進程的機制，在骨髓瘤細胞中，CKS1B基因敲除引起SKP2表達降低和p2

4、7表達上調，并且導致強烈的細胞凋亡和生長抑制。試驗結果提示CKS1B是通過SKP2-p27依賴性和非依賴性途徑影響骨髓瘤細胞生長和生存，并且SKP2-p27非依賴性途徑可能更重要一些。
　　 4.臨床分析和信息學分析提示CKS1B基因可能主要通過SKP2-p27非依賴性途徑影響骨髓瘤細胞生長和疾病進程
　　 為了進一步證實CKS1B影響骨髓瘤細胞生長的機制中的確存在SKP2-p27非依賴性途徑，在351個接受TT2治療方

5、案的多發(fā)性骨髓瘤新診斷病人中，利用Kaplan-Meier生存曲線分別比較CKS1B高/低表達、SKP2高/低表達以及p27低/高表達病人的生存率。結果顯示，CKS1B高表達的病人生存期明顯短于低表達的病人，P<0.001；而SKP2高、低表達的病人生存時間沒有明顯的差異；p27低、高表達的病人生存時間也沒有明顯的差異。
　　 這個臨床證據(jù)表明，CKS1B、SKP2和p27對多發(fā)性骨髓瘤疾病進程的影響不同，只有CKS1B的表達顯

6、著影響疾病的進行和惡化。
　　 5.骨髓瘤細胞中CKS1B非依賴SKP2-P27激活STAT3，MEK/ERK和BCL2信號途徑
　　 根據(jù)信息學分析的提示，在CKS1B基因敲除骨髓瘤細胞系OCI-MY5中，通過Western-Blot篩選了MAPK，NF-kB，TP53，P13K/AKT,STAT3等重要細胞信號途徑的主要信號分子。檢測到在骨髓瘤細胞OCI-MY5中，CKS1B基因敲除后引起下列信號分子蛋白表達下調。<

7、br>　　 為了進一步明確STAT3，MEK/ERK，BCL2是CKS1B的下游調控分子，通過Western-Blot檢測了CKS1B cDNA轉染細胞系OCI-MY5和XG1中以上分子的表達。結果顯示，在CKS1B外源性高表達的細胞中，p-MEK1/2，p-ERK1/2，p-STAT3，MCL-1，和P—BCL2表達上調。這些結果證實，STAT3，MEK/ERK，BCL2是CKS1B的下游調控分子，CKS1B可能通過它們影響骨髓瘤細

8、胞生長和生存。
　　 6.CKS1B通過激活STAT3/MCL1信號通路促進骨髓瘤細胞增殖和生存
　　 胰島素樣生長因子1是得到公認的骨髓瘤細胞生長因子，能激活STAT3信號途徑，促進STAT3磷酸化。為了研究STAT3在CKS1B促進骨髓瘤細胞增殖和生存中所發(fā)揮的作用，用含IGF-1的培養(yǎng)基培養(yǎng)CKS1B基因敲除的KMS28PE,OCI-MY5，和XG1細胞72小時。Western-Blot證實，在IGF-1培養(yǎng)的細胞

9、p-STAT3，MCL1表達增高。CKS1B基因敲除的細胞，通過IGF-1上調p-STAT3的表達后，細胞凋亡和抑制生長被部分阻止。以上結果證明了CKS1B通過激活STAT3/MCL1影響骨髓瘤細胞的增殖和生存。
　　 抗生素肖夫齊特，已被證明是JAK/STAT信號通路的特異性抑制劑，能夠在骨髓里細胞中抑制STAT3的磷酸化。為了證明JAK/STAT3是CKS1B下游信號通路并觀察靶向阻斷STAT3通路對CKS1B高表達骨髓瘤細

10、胞生長的影響，將CKS1B轉染的骨髓瘤細胞OCI-MY5和XG1，在含10nM Nif培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。WB驗證，Nif處理后的細胞p-STAT3蛋白水平下降。與EV細胞相比，CKS1B轉染的OCI-MY5和XG1細胞有更高的細胞死亡率。CKS1B高表達的細胞對STAT3特異性抑制劑Nifi誘發(fā)的細胞凋亡更敏感。
　　 7.CKS1B通過激活MEK/ERK信號通路促進骨髓瘤細胞增殖和生存
　　 在CKS1B基因敲除后

11、的細胞中，通過LentiVirus轉染MEK1-cDNA，使MEK1基因特異性高表達。WB驗證MEK1轉染細胞后p-MEK1/2和p-ERK1/2表達大幅度增加，并且磷酸化p-BCL2被激活。說明轉染MEK1導致的MEK/ERK通路的激活，抵消了CKS1B基因敲除導致的bcl2下調，從而證明BCL2是MEK/ERK下游調控分子。MEK1基因高表達，同時CKS1B基因敲除的骨髓瘤細胞KMS28PE,OCI-MY5，和XG1，雖然仍存在細胞

12、凋亡和生長受抑制，但是與單純CKS1B基因敲除的細胞相比較，細胞死亡率顯著性降低，存活細胞總數(shù)也顯著性增多。由此證明，MEK/ERK的外源性高表達和磷酸化激活，部分抵消了CKS1B基因敲除引起的骨髓瘤細胞死亡和生長抑制。以上研究證明，CKS1B通過激活MEKK/ERK通路，以及其下游的BCL2通路，影響骨髓瘤細胞的增殖和生存.
　　 8.BCL2信號通路的激活與CKS1B介導的骨髓瘤細胞增殖和存活相關
　　 實驗結果已經

13、提示BCL2是CKS1B和MEK/ERK信號通路的下游調控分子，為了確證BCL2在CKS1B促進骨髓瘤細胞生長的機制所起的作用，在CKS1B基因敲除后細胞中，通過LentiVirus轉染BCL2-cDNA，使BCL2過表達。Western-Blot驗證p-BCL2磷酸化被激活。BCL2過表達，同時CKS1B基因敲除的骨髓瘤細胞，雖然仍存在細胞凋亡和生長抑制，但是與單純CKS1B基因敲除的細胞相比較，細胞死亡率顯著性降低，存活細胞總數(shù)也顯

14、著性增多。由此證明，BCL2的外源性高表達和BCL2磷酸化，部分抵消了CKS1B基因敲除引起的骨髓瘤細胞死亡和生長抑制。以上研究證明了，BCL2在CKS1B促進骨髓瘤細胞的增殖和生存的過程中發(fā)揮重要作用。
　　 9.對CKS1B高表達的細胞聯(lián)合應用STAT3、MEK和BCL2抑制劑，存在協(xié)同作用
　　 由于CKS1B通過激活MEK/ERK和STAT3信號通路促進骨髓瘤細胞生長，靶向于這2條通路的藥物聯(lián)合應用可能會對骨髓瘤

15、細胞造成更強有力的殺傷效果。
　　 使用STAT3抑制劑聯(lián)合MEK1抑制劑，或者聯(lián)合BCL2抑制劑，處理CKS1B高表達的骨髓瘤細胞OCI—MY5Y。結果顯示聯(lián)合應用這2條信號通路抑制劑，都對CKS1B高表達細胞和空白對照細胞造成強烈的細胞毒作用，而CKS1B過表達細胞的死亡率顯著更高，效果強于單獨用藥。我們又在CKS1B高表達的細胞XG1中重復了這一實驗，得到相同的結果。這一實驗進一步證實了，與CKS1B表達低的骨髓瘤細胞相比

16、，對CKS1B高表達的骨髓瘤細胞應用STAT3和MEK/ERK抑制劑治療方案，療效會更好。
　　 10.FOXM1在骨髓瘤細胞中抑制CKS1B的表達并上調P27，同時也被P27正反饋調控
　　 CKS1B在多發(fā)性骨髓瘤病人中高表達已經被多個研究者所證實，而CKS1B在骨髓瘤細胞中增高的機制，除了與染色體1q21區(qū)域擴增外相關，并無更多的研究。
　　 有文獻報道在人骨肉瘤中，轉錄因子FOXM1能上調CKS1的表達，

17、臨床觀察和實驗室資料也發(fā)現(xiàn)FOXM1高表達的MM病人預后差。為了研究FOXM1與CKS1B之間的關系，我們建立了FOXM1高表達骨髓瘤細胞系，WB驗證FOXM1過表達引起CKS1B蛋白水平上調，和P27蛋白水平下調；而WB也顯示，CKS1B基因敲除后并沒有引起FOXM1表達水平的變化，而P27過表達則導致FOXM1表達增加。因此FOXM1是CKS1B的上游調控基因，能抑制CKS1B從而減少P27的降解，但是當P27的表達增高時，反過來又

18、促進了FOXM1的表達，F(xiàn)OXM1-CKS1B-P27之間存在相互作用的調控關系。
　　 小結：本課題的研究，探討了CKS1B在骨髓瘤中過表達的機制，證實了骨髓瘤細胞中CKS1B接受轉錄因子FOXM1的正向調控；證明了CKS1B基因促進骨髓瘤細胞生長存活和對多種抗腫瘤藥物耐藥疾?。魂U述了CKS1B促進骨髓瘤細胞生長的SKP2-p27非依賴性機制，證實CKS1B通過激活STAT3,MEK/ERK/BCL2信號通路促進骨髓瘤細胞生長