體外構(gòu)建U6-H1雙啟動(dòng)子SECs及其對(duì)HepG2細(xì)胞端粒酶活性抑制的研究.pdf

1、目的：利用重疊延伸拼接(splicing by overlap extension，SOE)PCR技術(shù)構(gòu)建相對(duì)排列的U6/H1雙啟動(dòng)子siRNA表達(dá)框架(siRNAexpression cassettes，SECs)，并針對(duì)人端粒酶hTERT基因外顯子不同片段構(gòu)建三條U6/H1雙啟動(dòng)子SECs，通過(guò)對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞端粒酶hTERT基因表達(dá)進(jìn)行RNA干擾來(lái)考察U6/H1啟動(dòng)子SECs的干擾作用，從而為siRNA的制備及腫瘤基因治

2、療探索新的途徑。 方法：分別以pSUPER質(zhì)粒和pRNAT-U6.1/Neo質(zhì)粒為模板，根據(jù)端粒酶hTERT基因外顯子核酸序列(genebank (NM_198253))1778-1796，2650-2668，1943-1961三個(gè)位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)特異引物，利用重疊延伸拼接PCR方法構(gòu)建兩端為相對(duì)排列的U6和H1啟動(dòng)子、中間部分為與端粒酶hTERT特定序列同源的可雙向轉(zhuǎn)錄的SECs。將該產(chǎn)物純化后用磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，

3、用適時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞hTERT mRNA的表達(dá)量，用TRAP-PCR銀染法定性檢測(cè)端粒酶活性，來(lái)觀察構(gòu)建的U6、H1雙啟動(dòng)子SECs的RNA干擾作用。 結(jié)果：2.5％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物顯示：第一階段PCR反應(yīng)產(chǎn)物單U6啟動(dòng)子正義SECs片段、單H1啟動(dòng)子反義SECs片段長(zhǎng)度分別為335bp和245bp，第二階段PCR片段長(zhǎng)度分別為反應(yīng)產(chǎn)物U6、H1雙啟動(dòng)子SECs片段長(zhǎng)度為561bp。將四段雙啟動(dòng)子SECs產(chǎn)

4、物純化后分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，檢測(cè)端粒酶hTERT mRNA及活性，針對(duì)hTERT(genebank NM_198253)1778-1796，2650-2668，1943-1961的U6、H1雙啟動(dòng)子SECs對(duì)后hTERT mRNA量顯著下降，端粒酶活性明顯降低。hTERTmRNA表達(dá)的抑制率分別為37.0％、50.1％和37.0％。處理組的相對(duì)端粒酶活性抑制率分別為55.0％、76.5％和47.6％。而陰性對(duì)照SECs無(wú)RNA干擾作