沉默酸敏感離子通道1a對胞外酸化誘導大鼠關節(jié)軟骨細胞自噬的影響及其可能機制.pdf

1、酸敏感離子通道(acid-sensing ion channels，ASICs)是一類廣泛存在于細胞膜上的陽離子通道，H+是最早發(fā)現(xiàn)的ASICs通道激動劑，開放的通道對Na+、Ca2+具有可通透性，參與細胞病理生理功能的改變。自噬(Autophagy)是一種依賴于溶酶體的細胞自我降解過程，具有多種生理病理功能。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)大鼠關節(jié)軟骨細胞存在ASICs表達，胞外酸化刺激軟骨細胞，細胞自噬水平升高，細胞凋亡增加，但具體機制尚不明確

2、。本研究選用大鼠關節(jié)軟骨細胞為研究對象，胞外酸化刺激軟骨細胞為體外模型，采用小分子干擾RNA(siRNA)技術沉默ASIC1a基因表達，探討ASIC1a對胞外酸化誘導的大鼠關節(jié)軟骨細胞自噬的影響及其可能機制。
　　目的：本研究旨在觀察 ASIC1a對胞外酸化誘導大鼠關節(jié)軟骨細胞自噬活化的影響，并探討其可能的分子機制。
　　內(nèi)容：
　　1.觀察不同的胞外酸化刺激條件下，大鼠關節(jié)軟骨細胞自噬水平變化；
　　2.利用小

3、分子干擾RNA(siRNA)技術建立體外ASIC1a的表達沉默模型并驗證其沉默效率；
　　3.觀察沉默或阻滯ASIC1a后，關節(jié)軟骨細胞自噬水平的變化；
　　4.探討ASIC1a參與胞外酸化誘導關節(jié)軟骨細胞自噬活化的機制；
　　方法：
　　1.不同胞外酸化條件(pH7.4、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0)/(pH6.0刺激15min、30min、1h、2h、3h、4h、5h)，作用于大鼠關節(jié)軟骨細胞，通過

4、 Western-blot法檢測自噬蛋白LC3Ⅱ表達。
　　2.通過合成特異性熒光短鏈ASIC1a siRNA-FAM建立體外ASIC1a表達沉默模型，采用熒光倒置顯微鏡、Western-Blot及實時熒光定量PCR(q-RT-PCR)法檢測ASIC1a沉默效率和對ASIC1a mRNA和蛋白表達的影響；
　　3.選擇大鼠關節(jié)軟骨細胞為實驗對象，設正常組、pH6.0酸化模型組、PcTx1組（100ng/mL）、特異性ASIC

5、1a siRNA沉默組、ASIC1a siRNA沉默陰性對照組，激光共聚焦技術檢測胞內(nèi)[Ca2+]i水平；吖啶橙染色(Arcidine Orange，AO)觀察軟骨細胞酸性小體形成情況；實時熒光定量PCR及Western-Blot法檢測關節(jié)軟骨細胞自噬相關基因LC3Ⅱ、Beclin1和ULK1含量；
　　4.選擇大鼠關節(jié)軟骨細胞為實驗對象，設正常組、pH6.0酸化模型組、BAPTA-AM組、特異性ASIC1a siRNA沉默組、A

6、SIC1a siRNA沉默陰性對照組、BAPTA-AM+特異性ASIC1a siRNA沉默組，GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染觀察細胞內(nèi)LC3水平；實時熒光定量PCR及Western-Blot法檢測關節(jié)軟骨細胞自噬相關基因?LC3Ⅱ、Beclin1和ULK1含量；
　　5.關節(jié)軟骨細胞胞外酸化刺激，采用Western-blot法檢測各組細胞 CaMKKβ、AMPK、mTOR的磷酸化水平；
　　6.胞外酸化刺激大鼠關節(jié)軟骨細胞，設正常組

7、、pH6.0酸化模型組、3-MA自噬抑制劑組、特異性ASIC1a siRNA沉默組、ASIC1a siRNA沉默陰性對照組、3-MA+特異性ASIC1a siRNA沉默組，Hoechst33342染色分析細胞凋亡情況；流式細胞術觀察細胞凋亡；實時熒光定量PCR法檢測關節(jié)軟骨細胞凋亡相關基因?Bax和Bcl-2的含量。
　　結果：
　　1.胞外酸化刺激大鼠關節(jié)軟骨細胞，自噬標志性蛋白 LC3Ⅱ呈時間和pH依賴性增加，且在pH6

8、.0，3h時表達量達到最大水平；
　　2.化學合成的特異性ASIC1a siRNA可成功轉(zhuǎn)染入大鼠關節(jié)軟骨細胞，轉(zhuǎn)染后，軟骨細胞ASIC1a mRNA和蛋白水平顯著下調(diào)；
　　3.采用ASIC1a阻滯劑PcTX1和ASIC1a siRNA可導致關節(jié)軟骨細胞胞內(nèi)Ca2+濃度降低，并且可以抑制胞外酸化誘導軟骨細胞自噬活化，表現(xiàn)為：LC3Ⅱ、Beclin1和ULK1表達量顯著下調(diào)，AO染色結果表明細胞內(nèi)酸性自噬溶酶體數(shù)目減少；4．

9、ASIC1a siRNA和BAPTA-AM組中胞外酸化誘導的大鼠關節(jié)軟骨細胞自噬活化減少，表現(xiàn)為：LC3Ⅱ、Beclin1和ULK1的水平顯著下調(diào)，細胞內(nèi)GFP-LC3數(shù)目減少。
　　5.沉默ASIC1a組或BAPTA-AM組可抑制胞外酸化誘導的CaMKKβ及AMPK磷酸化水平升高和mTOR磷酸化水平降低。
　　6.沉默ASIC1a或3-MA自噬抑制組，Bax mRNA表達量下降，Bcl-2 mRNA表達量升高，軟骨細胞凋亡