角膜移植排斥反應相關的淚液蛋白組學研究.pdf

1、第一章:大鼠角膜移模型的建立和排斥反應相關蛋白組學分析
　　目的：
　　建立大鼠自體移植模型和異體移植模型，通過同位素標記相對和絕對定量技術(iTRAQ)為基礎的蛋白質組學研究篩選出與角膜移植排斥發(fā)生、發(fā)展相關的差異蛋白，并運用生物信息學技術，分析其與角膜移植排斥反應可能相關的機制，為進一步發(fā)展新的排斥反應監(jiān)測、預防、治療手段奠定基礎。
　　材料和方法：
　　1.成年Wistar大鼠42只，隨機分為三組，分別對右

2、眼行同種異基因角膜移植（SD大鼠為供體，Wistar大鼠為受體），同種同基因角膜移植（自體原位角膜移植）及空白對照。
　　2.術后每天觀察植片水腫、渾濁和新生血管情況。
　　3.術后2、7、14天收集各組大鼠淚液，每只約10μl，凍存于80℃以備后用。
　　4.將大鼠淚液樣本離心后取上清液，經多重吸附去除系統(tǒng)(MARS)去除高豐度蛋白。然后對這些淚液標本進行蛋白提取、定量和酶解。
　　5.iTRAQ八標試劑標記后

3、（113標記空白對照組，115標記異體移植組2d，116標記異體移植組7d，117標記異體移植組14d，118標記自體移植組2d，119標記自體移植組7d，121標記自體移植組14d），進行二維液相色譜-串聯(lián)質譜(2DLC-MS/MS)分析。
　　6.利用ProteinPilot軟件進行搜庫并定量。差異表達蛋白界值設定:大于2為顯著上調(p＜0.05)，小于0.5為顯著下調(p＜0.05)。
　　7.觀察各組間蛋白表達的差異

4、和各組內不同時間點蛋白表達的差異。對各組和各時間點差異表達的蛋白進行生物信息學分析，包括分層聚類分析、GO分析和通路分析，尋找角膜移植排斥反應相關的差異蛋白。
　　結果：
　　1.角膜移植術后，除術后2天兩組大鼠角膜植片渾濁度沒有統(tǒng)計學差異外(p=0.123)，其余角膜植片在各時間點渾濁、水腫、新生血管及RI值差異有顯著性(p＜0.05)。
　　2.共鑒定出iTRAQ標記的差異蛋白277個。在異體移植組中2d、7d、1

5、4d這三個時間點發(fā)生顯著上調/下調的蛋白分別為:35個、36個、31個。
　　3.在異體移植組中，GO分析發(fā)現(xiàn)神經系統(tǒng)調節(jié)、自由基的清除、細胞的死亡與存活、細胞運動富集度較高;pathway分析顯示LXR/RXR的活化、急性時相反應信號通路、網格蛋白介導的內吞作用信號通路和肌動蛋白細胞骨架信號通路富集度較高。與自體移植相比，異體移植富集度顯著增高的通路有:LXR/RXR的活化通路、網格蛋白介導的內吞作用信號通路。
　　4.C

6、oronin-1A在異體移植組中明顯高于自體移植組。在異體移植組中，其在排斥開始發(fā)生時即7d達到峰值，而在自體移植組中，其隨時間推移逐漸降低。
　　5.Vitamin-D binding protein(DBP)在移植組第14天明顯上調。
　　結論：
　　1.Itraq為我們從整體上了解角膜移植排斥發(fā)生、發(fā)展過程中蛋白質的差異表達，從而篩選出有意義的蛋白提供了良好的平臺。對樣本量小、極性蛋白、及酸性堿性蛋白具有很高的檢

7、出率，可信度高，可重復性強。淚液樣本的收集對眼局部和全身無影響。由于淚液樣本量較少，選用itraq技術對淚液中蛋白質的檢測具有很高的效率。
　　2.生物信息學的方法可以擴展思路和視野，有助于我們進一步從整體上了解差異表達蛋白的功能和調控。本研究提示參與神經系統(tǒng)調節(jié)的蛋白與植片的排斥相關，而參與氧自由基的活化的蛋白與角膜內皮細胞凋亡以及白細胞積聚、免疫損傷和新生血管的形成相關。LXR/RXR通路可能通過影響脂質代謝、葡萄糖代謝和巨噬

8、細胞相關基因表達影響植片的存活。肌動蛋白細胞骨架信號通路參與免疫細胞的趨化移行、抗原識別、信號轉導、免疫突觸形成、活化、增殖分裂等過程，從而影響免疫排斥反應。
　　3.Coronin-1A可能是排斥發(fā)生早期有意義的生物學標記物，它通過影響T細胞的遷移和T細胞與APCs相互作用參與排斥反應的發(fā)生。
　　4.DBP可能通過影響巨噬細胞活化和趨化參與角膜移植排斥反應。
　　第二章抗排斥藥物干預對于角膜移植排斥反應相關蛋白表達

9、的影響
　　目的：
　　通過iTRAQ蛋白組學技術，觀察抗排斥藥物地塞米松和環(huán)孢素(CsA)對大鼠角膜移植模型淚液中蛋白質的影響，并運用生物信息學技術，分析差異表達的蛋白在角膜移植排斥發(fā)生、發(fā)展中的作用機制。
　　方法：
　　1.成年Wistar大鼠28只，隨機分為2組，對右眼行同種異基因角膜移植(SD大鼠為供體，Wistar大鼠為受體)。術后兩組分別給予地塞米松眼水和CsA眼水，觀察植片排斥情況?？瞻讓φ战Mwi

10、star大鼠14只。
　　2.術后2、7、14天收集各組大鼠淚液，每只約10μl，凍存于80℃以備后用。
　　3.iTRAQ八標試劑標記（114標記對照組;115標記環(huán)孢素2d;116標記環(huán)孢素7d;117標記環(huán)孢素14d;118標記地塞米松2d;119標記地塞米松7d;121標記地塞米松14d）。其余操作同第一章。
　　結果：
　　1.用藥組除第2天外，其他時間點RI均低于未用藥組。地塞米松組和CsA組之間RI

11、無明顯差異。
　　2.共鑒定出iTRAQ標記的差異蛋白440個。
　　3.地塞米松組2天、7天、14天這三個時間點發(fā)生顯著上調/下調的蛋白分別為:36個、41個、9個。
　　4.環(huán)孢素組2天、7天、14天這三個時間點發(fā)生顯著上調/下調的蛋白分別為45個、49個、43個。
　　5.對地塞米松組進行GO分析發(fā)現(xiàn)細胞的死亡與存活，皮膚疾病，蛋白合成，神經系統(tǒng)疾病等有關的生物學過程富集程度較高，pathway分析顯示顯示

12、EIF2信號通路、LXR/RXR活化信號通路、網格蛋白介導的內吞作用信號通路、急性期反應信號通路富集度較高。與未用藥移植組相比，LXR/RXR活化信號通路、網格蛋白介導的內吞作用信號通路、急性期反應信號通路和肌動蛋白細胞骨架信號通路均有不同程度的下降。
　　6.對環(huán)孢素組進行GO分析發(fā)現(xiàn)細胞的死亡與生存、蛋白合成、皮膚疾病、免疫性異常等富集度較高，pathway分析顯示顯示LXR/RXR活化通路、EIF2信號通路、網格蛋白介導的內

13、吞作用信號通路、急性期反應信號通路富集度較高。與未用藥移植組相比，網格蛋白介導的內吞作用信號通路、急性期反應信號通路、肌動蛋白細胞骨架信號通路的富集度均有不同程度下降。
　　7.coronin-1A上調的程度明顯低于未用藥組（未用藥組:2d=5.75，7d=8.24，14d=4.29;地塞米松組:2d=5.86，7d=1.63，14d=1.55; CsA組:2d=3.80，7d=3.40，14d=3.02)。
　　8.DBP

14、在用藥組顯著低于未用藥組。
　　結論：
　　1.EIF2信號通路可促進角膜內皮細胞的一些損傷修復機制，從而使其能夠更好的跨過細胞阻滯，抵抗凋亡。
　　2.急性時相蛋白與角膜移植排斥的發(fā)生密切相關。與未用藥組相比，其在用藥組中明顯降低，提示急性時相反應蛋白還與與排斥的程度相關，因此，淚液中的急性時相蛋白可能可作為植片排斥的檢測指標，指導臨床的早期診治和檢測療效。
　　3.抗排斥藥物可能通過降低coronin-1A的

15、表達，影響T細胞的遷移和T細胞與APCs相互作用，從而減輕角膜移植排斥反應。
　　4.抗排斥藥物干預對于DBP有明顯影響，可以考慮DBP作為評價角膜移植術后預后的指標。
　　第三章人淚液中角膜移植排斥反應相關蛋白篩選及臨床應用初探
　　目的：
　　應用iTRAQ蛋白質組學技術，對臨床PKP術后發(fā)生角膜移植排斥反應和未發(fā)生角膜移植排斥反應病人淚液中的蛋白質組進行檢測，以求在動物模型的基礎上，進一步深入研究探索角膜移

16、植排斥的發(fā)生機制，并發(fā)現(xiàn)新的生物學標記物，為排斥發(fā)生的早期診治和新藥的開發(fā)提供新思路。
　　材料與方法
　　1.穿透性角膜移植術后，發(fā)生急性排斥的患者10例，簡稱排斥組，收集其淚液;穿透性角膜移植術后（＞2周）未發(fā)生排斥的患者10例，簡稱未排斥組。排斥組和未排斥組術后按常規(guī)局部或全身使用糖皮質激素、環(huán)孢素A以預防術后排斥。
　　2.排斥組患者在臨床診斷為角膜移植排斥反應時收集基礎淚液，未排斥組于術后＞2周采集。淚液樣本

17、置于-80℃保存。
　　3.iTRAQ四標標記:117未排斥組;121排斥組。差異表達蛋白界值設定:大于1.3為顯著上調(p＜0.05)，小于0.77為顯著下調(p＜0.05)。其余操同第一章相關內容。
　　4.利用Ingenuity生物通路分析軟件分析所鑒定蛋白間的交互作用。
　　結果：
　　1.發(fā)生排斥的10例患者中，包括4名角膜白斑、3名病毒性角膜炎、1名真菌性角膜炎、1名角膜穿孔和一名未規(guī)律用藥的圓錐角膜

18、。
　　2.共鑒定出iTRAQ標記的蛋白428個。顯著變化的差異蛋白7個，上調的有叢生蛋白(Clusterin)、富含脯氨酸蛋白4(proline-rich protein4)和α-淀粉酶2B(α-amylase2B)，下調的有脂鈣蛋白-1（lipocalin-1）、細胞外糖蛋白(extracellular glycoprotein lacritin)、血清白蛋白(serum albumin)和轉錄因子7（transcriptio

19、n factor7-like1）。
　　3.GO分析結果顯示細胞間的相互作用、cell compromise、器官損傷和異常等功能的富集度較高;pathway分析顯示LXR/RXR活化信號通路、原發(fā)免疫缺陷信號通路和急性期反應信號通路的富集度較高。
　　4.IPA分析發(fā)現(xiàn)盡管泛素結合酶(ubiquitin conjugation enzyme，UBC)未被iTRAQ檢測出，但是UBC與多種鑒定出的角膜移植排斥相關蛋白發(fā)生作用

20、。
　　結論：
　　1.角膜移植排斥發(fā)生的高危因素主要包括炎癥、角膜新生血管化、角膜新生淋巴管化、反復移植、大植片或不規(guī)則植片、感染和病毒復制（主要見于單皰病毒性角膜炎）。此外，即使在低危病人中，如不規(guī)律用藥，排斥風險也會明顯升高。
　　2.叢生蛋白、富含脯氨酸蛋白4、α-淀粉酶2B和脂鈣蛋白-1可能為角膜移植排斥反應的生物學標志物。
　　3.泛素結合酶(UBC)可能為多種排斥相關蛋白的上游分子，通過調控下游目標