人椎間盤細胞外基質蛋白的質譜研究.pdf

1、本實驗采用了蛋白質組學的方法，包括雙向凝膠電泳，質譜儀鑒定，對人的正常椎間盤組織內的細胞外基質小分子蛋白進行了初步的研究和分析，取得了有益的結果。 第一部分預實驗牛椎間盤的細胞外基質小分子蛋白的電泳分離及質譜分析。 目的：通過對牛椎間盤進行蛋白萃取，電泳分離以及質譜分析檢驗實驗設計的可行性。 方法：使用Heinegard的方法對牛椎間盤進行萃取，將萃取液上樣進行SDS．PAGE梯度電泳分離蛋白質，將分離的蛋白質條

2、帶進行染色切割，使用胰島素酶進行消化，使用基質輔助激光解吸附質譜儀進行蛋白質鑒定。 結果：結果顯示牛椎間盤萃取蛋白質在分子量16-250Kd范圍內能夠被很好的分離，通過質譜鑒定可鑒定出蛋白質種類，在所鑒定的蛋白質中不含膠原蛋白的成分。說明這種萃取方法不會破壞膠原網(wǎng)絡。 第二部分正常人椎間盤細胞外基質小分子蛋白的質譜鑒定研究。 目的：通過使用預實驗所確立的方法，對正常人的椎間盤組織進行蛋白質萃取，兩維電泳分離及質譜

3、鑒定，來確立正常人椎間盤細胞外基質小分子蛋白的蛋白質譜，為今后的進一步研究奠定基礎。 方法：使用Heinegard的萃取方法獲得萃取液，并通過超高速離心除去萃取液中的蛋白多糖成分，通過兩維電泳分離蛋白質，把確認的蛋白質點切割并進行胰島素酶消化，然后使用基質輔助激光解吸附質譜儀進行蛋白質鑒定。 結果：雙向電泳顯示，纖維環(huán)和髓核的細胞外基質小分子蛋白無明顯差異，纖維環(huán)和髓核中的小分子蛋白在pH3～10分子量16kd～250k

4、d．范圍內能被很好地分離，對各蛋白質點行質譜儀鑒定，分別確定了其中相同的19種蛋白質。 結論：雙向電泳可有效地分離椎間盤組織中細胞外基質小分子蛋白，通過質譜儀鑒定可以確定其組成成分，為進一步研究椎間盤軟骨細胞外基質小分子蛋白的功能及在椎間盤病變中的改變和所起的作用打下基礎。 第三部分退變椎間盤和正常椎間盤組織的細胞外小分子蛋白質譜鑒定結果的對比研究。 目的：通過對退變的椎間盤組織的細胞外小分子蛋白進行兩維電泳分離

5、和質譜鑒定，和正常的人椎間盤組織細胞外小分子蛋白質譜進行對比，以圖發(fā)現(xiàn)不同。 方法：使用罹患椎間盤突出癥患者手術中取出的椎間盤組織進行蛋白萃取，超高速離心取出蛋白多糖，兩維電泳分離，質譜儀鑒定。 結果：在完全相同的條件下對退變的椎間盤組織進行實驗的結果顯示出了非常明顯的不同之處，既在兩維電泳凝膠上退變的椎間盤組織蛋白質COMP的明顯缺失，經(jīng)過大量重復實驗驗證了不同之處的可重復性和穩(wěn)定性，確定了下一步的研究對象。

6、第四部分針對COMP及其裂解片斷的研究。 目的：通過以往的實驗中我們確立了以COMP為研究對象的研究方向。而某種蛋白的缺失主要是因為它本身發(fā)上了裂解而造成的，在以往對于關節(jié)軟骨的研究中發(fā)現(xiàn)，COMP的裂解位點一般是恒定的，故這部分實驗的目的是尋找該蛋白的裂解片斷，確定其裂解位點，為制備其特異性的抗體做準備。 方法：WesternBlot，硝酸銀染色及EUSA等方法。 結果：這部分實驗的進行尚未得出可靠的結果，但本