兩種過氧化物還原酶在日本囊對蝦先天免疫中的功能研究.pdf

1、先天免疫是生物體在長期的進化中獲得的一種抵御外界病原微生物入侵的天然防御機制，是宿主啟動免疫應答的基礎(chǔ)。無脊椎動物僅具備先天免疫系統(tǒng)，因而是研究先天免疫應答機制的理想生物。無脊椎動物先天免疫研究在以果蠅和線蟲為代表的模式生物中取得了較大的進展，獲得了深入的認識。近年來，以對蝦為代表的海洋無脊椎動物養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，但也頻繁遭受病害的侵襲。因此，需要深入研究對蝦的先天免疫應答機制，為相關(guān)產(chǎn)業(yè)的病害防控提供理論參考與技術(shù)支持。
　　研究

2、的科學問題及意義：
　　已知，在需氧生物中，由過氧化物歧化酶和過氧化氫酶等組成的抗氧化酶系統(tǒng)在生物體的先天免疫應答中發(fā)揮著重要功能。近期的研究成果表明，過氧化物還原酶(Peroxiredoxin，Prx)，作為一類多功能的、廣泛分布的硫醇依賴性的抗氧化酶，可能參與先天免疫應答。但是，其在先天免疫應答中的具體功能和發(fā)揮作用的分子機制尚不明確。因此，在本論文中我們選擇具有重要經(jīng)濟價值的無脊椎動物日本囊對蝦作為實驗材料，深入研究Prx1

3、亞型在對蝦抗白斑綜合癥病毒(White spot syndrome virus，WSSV)先天免疫和1-Cys Prx6亞家族蛋白在對蝦抗細菌先天免疫中的功能及其作用機制，以期能夠揭示這類抗氧化蛋白在動物先天免疫應答中的功能與分子機理，為深入理解動物體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)在免疫應答中的功能和對蝦病害防控提供幫助。
　　研究結(jié)果：
　　1、MjPrx1通過介導NF-κB同源蛋白MjDorsal二聚化，促進MjDorsal與病毒ie1

4、啟動子的結(jié)合，促進WSSV在對蝦體內(nèi)的復制
　　受WSSV感染后，MjPrx家族成員在日本囊對蝦鰓組織中呈現(xiàn)不同的表達變化，其中MjPrx1呈現(xiàn)出最為顯著的上調(diào)表達。RNA干擾實驗表明，干擾Mjprx基因的表達能夠提高WSSV感染對蝦的存活率，抑制WSSV在對蝦體內(nèi)的復制;而注射純化的MjPrx1重組蛋白則能夠降低WSSV感染對蝦的存活率，促進WSSV在對蝦體內(nèi)的復制，表明在對蝦體內(nèi)MjPrx1發(fā)揮促進WSSV復制的功能。免疫細胞

5、化學和染色質(zhì)共沉淀實驗證實，干擾Mjprx1基因的表達能夠抑制WSSV感染引起的核因子κB(Nuclear factor kappaB，NF-κB)同源蛋白MjDorsal的核移位及其與病毒極早期基因ie1啟動子的結(jié)合活性。免疫共沉淀結(jié)果顯示:在對蝦體內(nèi)，MjPrx1能夠與MjDorsal相互作用，形成二硫鍵連接的異二聚體形式;而且WSSV感染能夠顯著促進二者的相互作用。細胞實驗表明，MjPrx1蛋白能夠與MjDorsal中的Rel同源

6、結(jié)構(gòu)域(Rel homolog domain，RHD)以二硫鍵連接的方式形成異源二聚體，并介導MjDorsalRHD結(jié)構(gòu)域形成二硫鍵連接的同源二聚體。點突變和重組蛋白Pulldown實驗結(jié)果表明MjPrx1的Cys51殘基對MjPrx1與MjDorsalRHD結(jié)構(gòu)域的相互作用有重要影響。并且，對蝦體內(nèi)注射不同形式的MjPrx1突變體蛋白的實驗表明，Cys51殘基突變的MjPrx1突變體蛋白不能再發(fā)揮促進WSSV復制的功能，表明此氨基酸在

7、MjPrx1蛋白發(fā)揮促進病毒復制的功能中具有重要作用。以上研究結(jié)果證實:MjPrx1能夠通過與MjDorsal相互作用，介導其二聚化，促進其活化入核，增強其與WSSV極早期基因ie1啟動子的結(jié)合活性，促進WSSV在日本囊對蝦體內(nèi)的復制。
　　2、1-Cys亞型Prx6通過維持對蝦體內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)抗菌膚基因的表達，在對蝦抗細菌免疫中發(fā)揮作用
　　鰻弧菌感染日本囊對蝦后，能夠引起對蝦不同組織中MjPrx6上調(diào)表達和過氧化氫

8、(H2O2)濃度升高。RNA干擾和鰻弧菌感染實驗表明:干擾Mjprx6基因的表達引起對蝦存活率顯著降低、細菌清除能力下降，表明MjPrx6在對蝦抗細菌免疫中具有重要作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，干擾Mjprx6會引起對蝦體內(nèi)H2O2異常升高，并且能夠抑制細菌感染誘導的某些抗菌肽(antimicrobial peptides，AMP)基因的上調(diào)表達。向?qū)ξr體內(nèi)注射抗氧化劑NAC能夠降低Mjprx6干擾引起的H2O2異常升高，解除對AMP基因上調(diào)表

9、達的抑制作用。表明H2O2濃度可能在調(diào)節(jié)抗菌肽基因表達中發(fā)揮重要作用。向?qū)ξr體內(nèi)注射不同濃度的外源H2O2,模擬不同實驗中對蝦體內(nèi)H2O2的濃度變化，結(jié)果表明:注射較低濃度的H2O2能夠促進相應的AMP基因表達，但對Mjprx6基因表達不產(chǎn)生影響;而較高濃度的H2O2則抑制AMP基因的表達，但誘導Mjprx6基因上調(diào)表達。這些結(jié)果表明H2O2能夠以劑量依賴性的方式雙向調(diào)節(jié)AMP基因表達，并且誘導Mjprx6的上調(diào)表達。向Mjprx6干擾

10、組對蝦回補具有過氧化物還原酶活性的MjPrx6重組蛋白能夠顯著降低Mjprx6干擾引起的對蝦鰓組織H2O2異常升高，并修復Mjprx6干擾引起的對蝦細菌清除能力下降和AMP基因表達降低等異常表型;而注射無活性的MjPrx6C44S突變體則沒有相應的效果。RNA干擾和細菌清除實驗進一步表明，由MjPrx6所調(diào)節(jié)的抗菌肽在對蝦抗細菌免疫中發(fā)揮重要作用。這些結(jié)果表明:MjPrx6能夠通過發(fā)揮過氧化物還原酶活性，防止細菌感染過程中對蝦體內(nèi)H2O

11、2的過量產(chǎn)生，將H2O2濃度維持在促進AMP基因表達的適當水平，促進對蝦的抗細菌免疫反應。
　　研究的創(chuàng)新點：
　　本論文主要研究了兩種Prx亞型在日本囊對蝦先天免疫中的功能與分子機理。研究創(chuàng)新點主要包括以下幾個方面:
　　(1)證明Prx1能夠與NF-κB同源蛋白MjDorsal相互作用，介導其形成二硫鍵連接的同源二聚體形式，促進其活化入核，增強其與WSSV ie1啟動子結(jié)合從而促進病毒在對蝦體內(nèi)的復制;