三日齡大鼠缺氧缺血腦損傷與神經(jīng)功能障礙的實驗研究.pdf

1、第一部分三日齡大鼠缺氧缺血腦損傷后髓鞘化障礙與遠期認知缺陷的關系
　　目的：腦室周圍白質損傷是早產(chǎn)兒主要形式的腦損傷，導致腦癱與認知功能障礙等嚴重神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。但是早產(chǎn)兒腦損傷導致的髓鞘化障礙與遠期認知缺陷的關系，目前國內外研究較少。本研究采用三日齡大鼠缺氧缺血(Hypoxia-ischemia，HI)腦損傷模型，評價HI后早期和晚期兩個不同階段星形膠質細胞和小膠質細胞增生對少突膠質細胞髓鞘化的影響；并進一步通過Morris水迷

2、宮實驗，評估少突膠質細胞髓鞘化與遠期認知障礙的關系。
　　方法：三日齡SD大鼠右側頸總動脈結扎，然后置于37℃環(huán)境中，6％氧氣(其余為氮氣)，缺氧2.5h。對照組既不結扎右側頸總動脈，也不缺氧。①HI組與正常組大鼠(n=8只)，于HI后72h(早期階段)后進行O4、膠質纖維相關蛋白(glialfibrillaryacidicProtein，GFAP)、CD68免疫組化染色，觀察少突膠質前體細胞表達與星形膠質細胞、小膠質細胞增生的關

3、系。②P42的HI組(n=23只)與正常組(n=24只)大鼠，進行Morris水迷宮實驗評價認知功能。⑧P47的HI組(n=15只)與正常組(n=11只)大鼠，進行焦油紫染色，評估神經(jīng)病理學變化。④HI組與正常組大鼠(n=8只)，于HI后44天(晚期階段)進行髓鞘堿性蛋白(myelinbasicprotein，MBP)、2’，3’-環(huán)腺苷酸-3’-磷酸二酯酶(2’，3’-cyclicnucleotide3’-phosp-hodieste

4、rase，CNPase)染色，評價少突膠質細胞成熟程度；同時分別進行GFAP和CD68染色，分別標記膠質增生和小膠質細胞變化情況，觀察晚期階段它們對少突膠質細胞成熟的影響。
　　結果：①HI后72h，損傷側白質少突膠質前體細胞、星形膠質細胞、小膠質細胞數(shù)目明顯高于對照側與正常對照組(P<0.05)。②P42進行的Morris水迷宮實驗中，定位航行實驗結果顯示，HI組大鼠學習能力明顯下降，有較長的逃跑潛伏期與游泳距離；空間探索實驗結

5、果顯示，HI組大鼠記憶能力明顯下降，有較少的目標站臺穿越次數(shù)與較低的目標象限停留時間比例。③P47大鼠神經(jīng)病理結果顯示，HI組損傷側腦體積比率與胼胝體體積比率均明顯減少(P<0.05)。④P47大鼠腦組織MBP、CNPase免疫組化結果顯示，HI組大鼠損傷側白質MBP陽性面積與少突膠質細胞數(shù)目均明顯減少(P<0.05)，同時損傷側白質區(qū)有GFAP陽性的膠質瘢痕形成，明顯高于對照側與正常對照組(P<0.05)，而CD68陽性的小膠質細胞數(shù)

6、目在三者之間無明顯差別。
　　結論：①HI后72h，大量增生的星形膠質細胞與小膠質細胞是影響少突膠質髓鞘化的早期因素。②HI后44天，持續(xù)存在的膠質瘢痕是影響少突膠質細胞髓鞘化的晚期因素。③HI造成遠期的空間認知功能障礙。④少突膠質髓鞘化障礙是影響遠期認知功能障礙的重要機理之一。
　　第二部分三日齡大鼠缺氧缺血腦損傷后TRAIL及其受體的表達與神經(jīng)功能障礙的研究
　　目的：早產(chǎn)兒腦損傷是引起患兒傷殘的重要原因。最近研究

7、表明，早產(chǎn)兒腦室周圍白質損傷同時伴有灰質神經(jīng)元/軸突的病變，并且炎癥反應是導致腦損傷的重要機理之一。腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(tumornecrosisfactor-relatedapoptosis-inducingligand，TRAIL)與其死亡受體(deathreceptor，DR)、誘騙受體(decayreceptor，DcR)受體結合，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種炎性反應性疾病，但是在早產(chǎn)兒腦損傷中尚見報道；本研究采用三日齡大鼠

8、HI腦損傷模型，評估皮層TRAIL及其受體表達及相關的神經(jīng)行為功能改變情況。
　　方法：①三日齡SD大鼠右側頸總動脈結扎，然后置于37℃環(huán)境中，6％氧氣(其余為氮氣)，缺氧2.5h。對照組既不結扎右側頸總動脈，也不缺氧。②HI后24h(急性期)，HI組與正常對照組(n=8只)分別利用免疫組化染色及免疫熒光雙標、Westernblot、Real-timePCR等方法，從細胞水平、蛋白水平、基因水平觀察TRAIL及其死亡受體DR5、C

9、aspase-3等表達變化。③HI后7天(恢復期)，HI組與正常對照組(n=8只)分別進行利用NeuN免疫組化染色，觀察神經(jīng)元的表達。④HI后7天(恢復期)，HI組與正常對照組(n=6只)，分別進行蘇木素-伊紅染色，觀察腦組織病理學變化。⑤HI組(n=15只)與正常對照組(n=11只)分別于HI后24h、72h、5天、7天進行早期神經(jīng)行為評估(步態(tài)反射、翻正反射、懸崖回避、負向趨地反射)；觀察各組大鼠首次睜眼時間以評估神經(jīng)發(fā)育情況；各組

10、大鼠于P60進行T-迷宮自主交替實驗，評價遠期認知功能。
　　結果：①HI后24h，免疫組化結果顯示損傷側皮層表達大量的TRAIL、死亡受體DR5、誘騙受體DcR1、DcR2陽性細胞，數(shù)目明顯高于對照側和正常對照組(P<0.05)。并且損傷側皮層TRAIL/CD68雙陽性細胞數(shù)目明顯高于對照側。②Westernblot結果顯示損傷側皮層大量表達TRAIL、DR5蛋白(P<0.01)；Real-timePCR結果也顯示損傷側皮層大量

11、表達TRAIL、DR5、Caspase-3mRNA(P<0.01)。③HI后7天，免疫組化顯示損傷側皮層神經(jīng)元數(shù)目減少、結構異常、排列紊亂。④HI后7天，HE染色顯示損傷側神經(jīng)細胞固縮、細胞走向紊亂、結構欠清晰。⑤早期神經(jīng)行為結果顯示，HI組大鼠步態(tài)反射時間、翻正反射時間、懸崖回避反射時間、負向趨地反射時間均明顯延遲(P<0.05)；其次，HI組大鼠損傷側眼睛睜開時間明顯延遲，長于對照側和正常對照組(P<0.05)。T-迷宮自主交替實驗