流式細胞術檢測糖皮質激素受體評價激素反應性及人參總皂苷作用的研究.pdf

1、糖皮質激素(glucocorticoid,GC)在生物體的生長、發(fā)育、生殖、代謝、免疫及維持內環(huán)境穩(wěn)定等過程中都具有重要的調節(jié)作用。臨床上,GC又是應用最為廣泛的甾體激素類藥物,自20世紀50年代起就作為抗炎和免疫抑制劑,用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎病綜合征、慢性哮喘等疾病的治療。因此,GC是一種極具生理及藥理作用的甾體激素。 GC的效應是由糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor,GR)介導實現的。生物體組織細

2、胞對GC的反應性主要取決于兩個方面：內外環(huán)境中GC的水平以及個體自身對GC的敏感性,也就是GR介導GC信號轉導的效率。由于糖皮質激素在生命過程中所發(fā)揮的作用極其重要,完全的糖皮質激素抵抗是罕見的。然而,不同個體對糖皮質激素治療的反應存在較大差異,這種差異部分是由于GR數量和結合力下降引起的。過去已有研究發(fā)現哮喘病人在治療期間GR數量減少與激素療效下降之間具有一定的相關性。如能在治療前通過檢測GR預測激素反應性,調節(jié)激素用量,對可能發(fā)生激

3、素抵抗的病人早期采取聯合應用免疫制劑等措施,則有可能避免盲目大劑量使用激素帶來的副反應,使患者獲得較多的收益。另外,對于那些不得不長期大劑量激素治療的患者,即使是激素敏感,在經過一段時間治療后也不可避免地會出現激素反應性下降。GR下調是重要內因,然而目前尚缺乏有效的干預手段。 本課題組在體外和動物實驗中發(fā)現人參總皂苷能改善大劑量糖皮質激素導致的GR下調。但人參總皂苷能否在臨床中上調GR,并由此提高激素反應性,目前尚無相關報道。因

4、此,選擇一種可靠、簡便的臨床GR檢測方法,對于在治療前了解個體激素反應性,制定合理治療方案,及評價GR調節(jié)劑療效都具有重要的臨床意義。 目前比較常用的檢測GR的方法,比如3H標記的放射性配基結合分析、Western-blot,操作繁瑣,且無法在多種組織細胞混合存在的情況下反映某一特定細胞群或單個細胞中的GR,另外,3H標記的放射性配基由于需要使用放射性物質,使用受到很大限制。而流式細胞術的優(yōu)勢在于不僅操作簡便,可以根據細胞大小和

5、胞漿內顆粒密度,或者細胞表面分子標記來區(qū)分單個細胞,而且還以可通過熒光標記的配體和單克隆抗體同時檢測GR結合力和蛋白表達。 本課題的研究目的： 1、通過與傳統(tǒng)檢測GR方法比較,評價FITC-Dex和GR單克隆抗體兩種探針標記的流式細胞術同時檢測GR結合力和蛋白表達的可靠性； 2、采用流式細胞術觀察激素抵抗和激素敏感的系統(tǒng)性紅斑狼瘡和腎病綜合征病人GR的改變,初步探討其預測激素療效的可能性； 3、在本研究小

6、組體外和動物實驗發(fā)現人參總皂苷上調GR基礎上,采用該方法觀察人參總皂苷在臨床上對長期大劑量使用激素的系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人GR的影響。 本課題的研究意義在于：1.初步探討流式細胞術檢測GR預測激素反應性的可能性；2.初步證實人參總皂苷在臨床上可以通過上調GR增強激素效應。 本課題采用的方法： 1、給予U937和K562細胞株濃度為10-5M地塞米松處理48h,建立體外GR下調模型,分別采用放射性配基、Western-

7、blot和FITC-Dex和GR-mAb標記的流式細胞術檢測GR,評價該方法的可靠性；并采用激光共聚焦觀察免疫熒光標記的兩種探針對胞內GR染色后,GR在U937和K562細胞中的定位,及其對Dex干預的反應； 2、選擇35名系統(tǒng)性紅斑狼瘡及23名腎病綜合征患者,采用FCM檢測激素治療前同一時間點外周血T淋巴細胞(CD3+)和單核細胞(CD14+)亞群GR;系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人根據治療后的SLEDAI評分改變,腎病綜合征病人根據尿蛋

8、白變化,再分為激素抵抗和激素敏感組,觀察GR在兩組中的變化； 3、采用雙盲隨機對照設計,收集32例系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人,分為人參總皂苷干預組和安慰劑組,給予相應藥物治療3個月后,觀察可以反映病情的SLEDAI評分、ESR、C3、抗ds-DNA的變化,并采用FCM檢測治療前后GR,評價人參總皂苷對GR的影響及其與療效間的相關性。 結果表明： 1、U937和K562細胞株經Dex處理后,GR蛋白和結合力較空白組顯著下降

9、,FCM檢測到的結果分別與Western-blot和3H標記的放射性同位素檢測結果成正相關。激光共聚焦觀察在沒有經過Dex處理的對照組,anti-GR mAb染色后的GR主要存在于U937和K562細胞的胞漿中,核/漿比小于1,經過Dex處理48h后,兩種細胞株FITC平均熒光強度下降(p<0.01);在無Dex處理組,經FITC-Dex染色后的GR主要存在于胞核內,核/漿比大于1,MFI在U937和K562細胞中的核/漿比分別是1.1

10、4±0.06和1.28±0.13,經過Dex處理24h后,FITC平均熒光強度和核/漿比均顯著下調(p<0.01),核/漿比分別是0.94±0.05 and 0.82±0.06。 2、檢測部分SLE和NS病人治療前外周血GR,結果系統(tǒng)性紅斑狼瘡和腎病綜合征病人中的激素敏感組外周血CD3/GR和CD14/GR的結合力和蛋白表達與正常對照組比較均無明顯差異(all p>0.05)；在系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人中,激素抵抗組CD3/GR和CD

11、14/GR的結合力和蛋白表達與激素敏感組比較均顯著降低(all p<0.01)。在腎病綜合征病人中也得到了相似的結果,激素抵抗組CD3/GR和CD14/GR結合力較激素敏感組顯著降低(p<0.01),但是兩組間蛋白表達無顯著差異(p>0.05)； 3、評價人參總皂苷臨床療效,治療后三個月人參總皂苷組CD3+和CD14+細胞群GR蛋白表達變化與安慰劑組比較無顯著差異(p>0.05),但CD3+細胞群GR結合力較安慰劑組顯著增加(p

12、<0.01),CD14+細胞群GR結合力也較安慰劑組具有改善趨勢,但無統(tǒng)計學意義(p=0.28);治療后人參總皂苷組SLEDAI評分明顯下降,安慰劑組則升高,人參總皂苷組SLEDAI評分較安慰劑組明顯改善(p<0.01)：另外,人參總皂苷組ESR、抗ds-DNA、C3也均較安慰劑組有所改善,但兩組間差異無統(tǒng)計學意義(allp>0.05)。 根據以上結果可以初步得出以下結論： 1、兩種探針標記的流式細胞術檢測GR結合力和蛋