鎮(zhèn)痛藥對細胞縫隙連接功能的作用及其對順鉑細胞毒性的影響研究.pdf

1、研究背景 鎮(zhèn)痛藥廣泛應用于各種惡性腫瘤，特別是手術后和晚期腫瘤病人的麻醉及疼痛治療，因此，在臨床上常與抗腫瘤藥同時使用。但是，至今為止有關鎮(zhèn)痛藥對抗腫瘤藥物療效影響的研究報道很少。順鉑作為臨床上常用的廣譜化療藥，對睪丸癌、卵巢癌、肺癌和頭頸部癌等實體瘤都有很好的療效，是多種腫瘤化療方案中的組成藥物。使用順鉑進行化療的腫瘤病人，在用鎮(zhèn)痛藥進行麻醉及鎮(zhèn)痛時，是否對其療效產(chǎn)生影響，尚未見報道。 目前對鎮(zhèn)痛藥的作用機制較多集中于

2、神經(jīng)突觸及其相關離子通道的研究，而對鎮(zhèn)痛藥影響細胞信號轉(zhuǎn)導機制的作用及意義缺乏深入的研究和了解。有研究表明，鎮(zhèn)痛藥對細胞縫隙連接(gap junction，GJ)介導的細胞問通訊(gapjunctional intercellular communication，GJIC) 的影響可能是其鎮(zhèn)痛作用機制之一。 GJ 是細胞之間的一種蛋白質(zhì)連接通道，廣泛存在于實質(zhì)性臟器(如心臟，肝臟，腎臟，中樞神經(jīng)，皮膚，肌肉等)組織中，由特殊的通

3、道蛋白——連接蛋白(connexin，Cx)組成。6個Cx環(huán)繞在一起組成一個“半通道”(hemichannel，又稱為連接子connexon)。兩個位于各自細胞胞膜上的“半通道”對接在一起形成一個GJ。GJ溝通相鄰細胞的胞漿，細胞漿中分子量<1 kDa的物質(zhì)(如離子，細胞信號分子和代謝物質(zhì)等)可通過GJ擴散、轉(zhuǎn)運到與其毗鄰的細胞漿。GJ提供了一種細胞與細胞之間的直接聯(lián)系通道，是細胞之間信號傳遞的一種重要方式。現(xiàn)已證明GJ在同步細胞的活動

4、、維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、控制細胞的生長和發(fā)育等生命過程中發(fā)揮十分重要的作用；GJ異常與許多疾病(包括腫瘤)的發(fā)生、發(fā)展有密切的關系。最近有報道：在培養(yǎng)的正常細胞和腫瘤細胞，GJ能夠增強多種化學毒物引起細胞凋亡的作用。特別指出的是，GJ可增強抗腫瘤藥物順鉑的細胞毒性。盡管有許多研究探討了鎮(zhèn)痛藥對GJIC的影響，但結果并不一致；并且目前的研究只注重GJ與鎮(zhèn)痛藥鎮(zhèn)痛機制的關系，對鎮(zhèn)痛藥能否通過改變GJIC而影響抗腫瘤藥(如順鉑)的細胞毒性還未見

5、報道。本研究擬觀察不同化學結構的鎮(zhèn)痛藥(嗎啡、曲馬多和凱紛)對轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達Cx32的Hela細胞GJIC的作用；在此基礎上，進一步了解上述鎮(zhèn)痛藥對順鉑細胞毒性的影響，以及這種影響是否是通過改變GJ功能而產(chǎn)生的。 研究目的： 了解鎮(zhèn)痛藥對GJ功能和順鉑細胞毒性的影響；并探討鎮(zhèn)痛藥改變GJ功能的作用與其對順鉑細胞毒性影響的關系。為闡明鎮(zhèn)痛藥的作用機制和順鉑耐藥性產(chǎn)生的機理提供資料；為指導腫瘤化療病人合理使用鎮(zhèn)痛藥提供理論基

6、礎。 實驗方法： 轉(zhuǎn)染并表達含Cx32的Hela細胞的培養(yǎng)、篩選及誘導：本實驗室構建了一系列能夠表達同質(zhì)性Cx (homomeric，由同一種Cx組成的通道)或異質(zhì)性Cx(heteromeric，由不同Cx組成的通道)的載體質(zhì)粒。這種雙向質(zhì)?？梢栽谝粋€肩動子的控制下同時表達任意一種或兩種Cx。Cx的表達是可以控制的，一般情況下，Cx不表達；需要表達時，先用含G-418、潮霉素的培養(yǎng)基篩選細胞，然后在培養(yǎng)基中加入doxyc

7、ycline引起Cx表達。這樣，能夠避免因過度表達Cx引起的細胞傷害。 鎮(zhèn)痛藥對培養(yǎng)細胞GJ功能影響測定：將表達有Cx32的HeLa細胞與熒光指示劑Calcine-AM和DiI-CM共同孵育，使Calcine-AM和DiI-CM進入細胞。培養(yǎng)4小時，待形成穩(wěn)定的GJ后，用顯微熒光系統(tǒng)觀察，計數(shù)一個“供體細胞”周圍含有calcine的“接受細胞”作為GJ功能指標。 鎮(zhèn)痛藥對順鉑細胞毒性的影響測定：本研究采用Dr．Glaze

8、r報道的“標準細胞集落形成分析法”，測定順鉑對培養(yǎng)細胞(穩(wěn)定表達Cx32的HeLa細胞)的細胞集落(克隆)形成的影響。細胞集落形成反映了單個細胞的增殖潛力，能較靈敏地測定抗癌藥的活性。本實驗以順鉑降低細胞集落形成率(SurvivingFraction)作為順鉑的細胞毒性指標。用不同密度接種細胞的方法獲得有GJ形成(已融合)的細胞和無GJ形成(未融合)的細胞。在上述細胞，觀察GJ形成對順鉑的細胞毒性影響。細胞集落形成率(Surviving

9、 Fraction)=順鉑處理組的細胞集落數(shù)/未用順鉑處理組的細胞集落數(shù)為了避免不同生長期的細胞對順鉑敏感性的差異對實驗結果的影響，細胞在加入順鉑前24小時用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，使所有細胞均同步在G1期。 實驗結果： 1．嗎啡(10μg/ml)對表達Cx32的Hela細胞GJ功能無影響。而曲馬多和凱紛(1μg/ml，10μg/ml)對上述細胞的 GJ 功能有顯著的抑制作用(P<0.05)，凱紛的抑制作用強于曲馬多和2-AP

10、B(2.3μg/ml)。 2．順鉑(0.5μg/ml)能夠顯著降低表達Cx32的HeLa細胞集落形成率。在有GJ形成的細胞(高密度接種，生長融合的細胞)，順鉑的細胞毒性顯著大于無GJ形成細胞(低密度接種，細胞生長未融合)。在有GJ的細胞，用2-APB(2.3μg/ml)抑制GJ，可降低順鉑的細胞毒性。結果證明GJ能增強順鉑的細胞毒性；抑制GJ可使順鉑的細胞毒性降低。 3．曲馬多(10μg/ml)無細胞毒性。曲馬多和順鉑聯(lián)

11、合使用，在有GJ形成的細胞，細胞集落形成率顯著高于順鉑單用組；表明曲馬多能降低順鉑的細胞毒性。而在無GJ形成細胞，曲馬多并不能改變順鉑的細胞毒性。結果表明曲馬多可降低順鉑的細胞毒性；曲馬多對順鉑細胞毒性的影響是通過GJ產(chǎn)生的。 4．在有或無GJ形成的細胞，凱紛(10μg/ml)都降低細胞集落形成率，表明凱紛有一定的細胞毒性。在有GJ形成的細胞，凱紛和順鉑聯(lián)合使用組的細胞集落形成率顯著高于順鉑單用組；表明凱紛能降低順鉑的細胞毒性。