酵母雙雜交篩選FKBP38相互作用蛋白及SQSTM1-p62功能初步研究.pdf

1、細(xì)胞中的蛋白質(zhì)大多與其它蛋白結(jié)合而發(fā)揮作用，多種不同種類的蛋白質(zhì)可特異性地與其它蛋白質(zhì)相互作用結(jié)合成非共價復(fù)合物。研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用時，酵母雙雜交技術(shù)是常用方法。FKBP38(FK506-binding protein38)作為FKBP家族的一員，是一個多功能蛋白，通過與不同的蛋白相互作用參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡等多種生命過程，并可能與細(xì)胞內(nèi)氨基酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。本文采用酵母雙雜交技術(shù)，以FKBP38為誘餌蛋白篩選絨山羊胎兒成纖維細(xì)

2、胞(GFb)cDNA文庫，得到與FKBP38相互作用蛋白，并對靶蛋白進(jìn)行初步功能驗證，為進(jìn)一步了解FKBP38及其相互作用蛋白在調(diào)控細(xì)胞生長與代謝中的作用與機制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　實驗首先以pGBKT7-FKBP38為誘餌蛋白，用酵母雙雜交技術(shù)從pGADT7-cDNA文庫中篩選出與FKBP38相互作用的未知蛋白;然后對獲得的未知蛋白進(jìn)行一對一酵母轉(zhuǎn)化實驗和四輪篩選，鑒定陽性克隆，測序并通過序列比對分析鑒定編碼捕獲蛋白的基因;最后，

3、從篩選到的靶蛋白中選出SQSTM1/p62蛋白作為下一步研究目標(biāo)，采用免疫共沉淀驗證FKBP38與SQSTM1/p62之間的相互作用關(guān)系，構(gòu)建SQSTM1/p62基因真核表達(dá)載體及其靶向shRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染GFb，MTT法檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化，初步了解SQSTM1/p62基因的功能。
　　結(jié)果表明:1.含pGBKT7-FKBP38質(zhì)粒的Y2H酵母菌和含pGADT7-cDNA質(zhì)粒的Y187酵母菌進(jìn)行酵母雙雜交

4、后，通過四輪缺陷培養(yǎng)基及相應(yīng)抗生素篩選，獲得了7個酵母菌株;2.將獲得的7個酵母單克隆分別用一對一的酵母轉(zhuǎn)化實驗，驗證與FKBP38有相互作用后測序，分析序列確定篩選到的蛋白分別為eukaryotic translation initiation factor1(EIF1),40S ribosomal protein S5-like(LOC102183449), CD81 molecule(CD81),actin gamma2(ACTG

5、2), sequestosome1(SQSTM1),ArfGAP with coiled-coil, ankyrin repeat and PH domains3(ACAP3)和PDZ and LIM domain7(PDLIM7);3.利用免疫共沉淀實驗驗證FKBP38與SQSTM1/p62之間的相互作用;4.克隆得到的白絨山羊SQSTM1/p62基因cDNA全長1147bp，構(gòu)建了靶向SQSTM1/p62基因的shRNA載體pRNA

6、T-U6.1-shSQSTM1/p62和SQSTM1/p62基因過表達(dá)載體pIRES2-EGFP-SQSTM1/p62;5.SQSTM1/p62基因過表達(dá)載體與RNA干擾載體分別轉(zhuǎn)染GFb。與對照組相比，SQSTM1/p62基因轉(zhuǎn)錄后沉默時活細(xì)胞數(shù)量明顯降低，細(xì)胞增殖受到抑制;6.細(xì)胞周期檢測表明，與對照組S期細(xì)胞比率28.37％相比，SQSTM1/p62基因轉(zhuǎn)錄后沉默組S期細(xì)胞比率為17.26％，過表達(dá)SQSTM1/p62基因組S期細(xì)