新型熒光納米材料碳點的毒性及作用機制研究.pdf

1、將納米材料用于生物標(biāo)記與診斷成像，是當(dāng)前納米科技應(yīng)用于腫瘤醫(yī)學(xué)新興的研究領(lǐng)域，如何應(yīng)用納米材料獨特的小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、量子效應(yīng)、光、電、磁效應(yīng)等性質(zhì)來設(shè)計生物相容性良好的腫瘤診斷分子探針，提高腫瘤標(biāo)志物檢測的特異性與靈敏度，是目前腫瘤醫(yī)學(xué)對納米科技提出的極具挑戰(zhàn)性的問題。
　　納米材料要轉(zhuǎn)化為醫(yī)藥產(chǎn)品應(yīng)用于臨床，其生物安全性是一個必須解決的關(guān)鍵問題。迄今為止，國際上尚未制定出一套用于納米材料評價特定的指導(dǎo)原則。多數(shù)納米醫(yī)藥制品

2、的安全評價依然采用常規(guī)毒理學(xué)的評價指導(dǎo)原則。已有的研究表明，納米材料的尺寸形狀、表面電荷及其表面修飾等性質(zhì)均會對其生物學(xué)行為與生物效應(yīng)產(chǎn)生影響。近年來一些納米醫(yī)藥產(chǎn)品，經(jīng)常規(guī)毒理學(xué)評價定為無毒，但在使用過程中卻因為檢測到新的毒作用而被美國FDA撤出臨床。常規(guī)毒理學(xué)越來越不能適應(yīng)對納米生物醫(yī)藥制品安全評價的要求。制定一套客觀并能實時監(jiān)測納米顆粒在暴露過程中對機體可能得毒性作用的評價方法迫在眉睫，納米毒理學(xué)所肩負的任務(wù)任重而道遠。
　

3、　碳點是一種新型的熒光碳納米顆粒，其粒徑一般在10nm以下，具有良好的分散性和熒光穩(wěn)定性。這種碳納米材料具有傳統(tǒng)熒光染料所不具備的諸多優(yōu)良性質(zhì)，如:熒光強度高、抗光漂白能力強、激發(fā)光譜連續(xù)等。此外，碳點具有很好的水溶性，其表面的羧基易于進行生物偶聯(lián)與功能化修飾。碳點本身不含有任何有毒元素，與半導(dǎo)體量子點相比，展現(xiàn)出卓越的生物兼容性和環(huán)境友好性鑒于上述諸多優(yōu)良的理化性質(zhì)，碳點極具制備腫瘤診斷探針的潛質(zhì)，但是目前針對于碳點安全性評價的研究卻

4、非常稀少，評價內(nèi)容也不全面、不系統(tǒng)，對碳點可能的毒性作用機制更是缺乏深入的研究。
　　本課題承接了國家973項目——“應(yīng)用納米技術(shù)解決胃癌預(yù)警與早期診斷中的關(guān)鍵科學(xué)問題”中碳點（一種用于標(biāo)記胃癌早期診斷探針的納米材料）對生物體的毒理效應(yīng)及其作用機制的評價研究任務(wù)，我們以國家食品藥品監(jiān)督管理局藥物評價指南為基礎(chǔ)和指導(dǎo)，參照國際化學(xué)物毒理學(xué)檢測指南對碳點的生物學(xué)效應(yīng)和致毒機制進行了系統(tǒng)性評價。
　　研究內(nèi)容包括:
　　(1

5、)碳點的理化性質(zhì)表征。采用原子力顯微鏡、紫外可見光譜儀、熒光光度計等儀器分別對硝酸氧化法制備碳點的形貌、粒徑、吸收光譜、熒光光譜及熒光量子產(chǎn)率等參數(shù)進行了表征。
　　(2)碳點的急性、亞急性毒性測定。分別選用BALB/C小鼠和Wistar大鼠，一次性尾靜脈注射染毒，記錄了受試動物在給藥后不同時間點一般狀況、食物利用率、體重、血液學(xué)、血清生化指標(biāo)的變化及主要臟器的病理改變。
　　(3)碳點的遺傳毒性評價。選用沙門氏菌回復(fù)突變試

6、驗（受試菌株為鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102）、染色體畸變試驗、堿性單細胞凝膠電泳試驗及骨髓微核試驗四個組合試驗對碳點的致基因突變、染色體畸變和DNA損傷效應(yīng)進行了測定。
　　(4)碳點對免疫功能的影響。選用BALB/C小鼠作為模式動物，以尾靜脈單次及多次注射的方式染毒，在給藥后多個時間點，采用脾細胞增殖試驗、淋巴細胞種類及亞群分析、巨噬細胞中性紅吞噬試驗、免疫相關(guān)細胞因子分泌及表達水平檢測、免疫器官病理

7、形態(tài)分析等方法分別研究了碳點對小鼠巨噬細胞功能、T淋巴細胞與B淋巴細胞增殖活性及其介導(dǎo)的免疫功能和相關(guān)免疫器官病理變化的影響。
　　試驗結(jié)果如下:
　　(1)碳點的理化性質(zhì)表征結(jié)果表明，碳點的顆粒直徑在5～10 nm，紫外、紅外光譜證實了碳點表面富含羧基和羥基基團，從結(jié)構(gòu)上闡明了碳點具有很好的水溶性。熒光光譜分析表明碳點隨著激發(fā)光的不同可以發(fā)不同顏色的熒光，裸碳點在340 nm激發(fā)，可以發(fā)射強的藍色熒光，其熒光量子產(chǎn)率在0.

8、8％左右。
　　(2)碳點以單次靜脈注射方式染毒對模式動物沒有明顯的急性、亞急性毒性。動物的一般狀況良好;食物利用率、體重、血液學(xué)、血清生化指標(biāo)均沒有出現(xiàn)異常變化;主要臟器無明顯的病理改變。
　　(3)遺傳毒性組合試驗評價結(jié)果顯示，碳點在受試劑量內(nèi)不能誘導(dǎo)鼠傷寒沙門氏菌發(fā)生突變，對CHL細胞的染色體無致畸變作用，無明顯的DNA損傷效應(yīng)，不能誘發(fā)受試動物的骨髓紅細胞發(fā)生微核突變，說明碳點無明顯的遺傳毒性。
　　(4)免疫

9、毒性研究結(jié)果表明，碳點尾靜脈注射單次染毒，在暴露早期，巨噬細胞被激活功能增強，IFN-γ等細胞因子的分泌水平增加，但未見淋巴細胞種群與數(shù)量的顯著變化，未誘發(fā)明顯的免疫效應(yīng);但在染毒后第9天，碳點能顯著促進T淋巴細胞的活化增殖，提高IFN-γ與TNF-α的分泌水平，增強Th1細胞介導(dǎo)的免疫效應(yīng)。碳點多次染毒，T淋巴細胞亦出現(xiàn)明顯增殖，IFN-γ與TNF-α相關(guān)細胞因子分泌水平增加，且在基因水平的表達上調(diào)。碳點的持續(xù)暴露作用誘發(fā)了機體的氧化

10、應(yīng)激損傷，破壞了機體的免疫平衡狀態(tài)，導(dǎo)致相關(guān)靶器官出現(xiàn)了可代償?shù)牟±聿∽儭?br>　　本論文立題于當(dāng)前極具挑戰(zhàn)的納米材料安全性研究方向，通過一系列分子、細胞和動物水平的試驗，首次對碳點的生物安全性做了較系統(tǒng)、全面地評價。一般毒性與遺傳毒性評價結(jié)果表明碳點在受試劑量內(nèi)沒有明顯的毒性作用;免疫毒性研究結(jié)果顯示，碳點在單次染毒時可以促進Th1細胞介導(dǎo)的免疫效應(yīng)，但在多次給藥的情況下，碳點可誘發(fā)機體相關(guān)免疫器官發(fā)生可代償?shù)牟±聿∽?。上述試驗結(jié)果