小牛凝乳酶基因在大腸桿菌中可溶性表達研究.pdf

1、凝乳酶（Chymosin,CYM）是干酪生產中的關鍵酶，傳統(tǒng)的凝乳酶來源是沒有斷奶的小牛皺胃，但是隨著世界奶酪產業(yè)不斷發(fā)展壯大，每年宰殺上千萬頭犢牛以獲得凝乳酶的方法顯然是與現(xiàn)代工業(yè)發(fā)展極不協(xié)調的。為解決這一突出矛盾，80年代以來，美、日、英、蘇等國相繼開展了凝乳酶基因工程研究。由于重組凝乳酶在理化性質和生物學活性接近于天然蛋白質，且可以通過大規(guī)模制備源源不斷地獲得，目前已被廣泛的應用于干酪的生產。
　　在研究和生產中，大多數(shù)情況

2、下我們都希望能夠獲得大量的可溶性重組蛋白。但是，大腸桿菌表達系統(tǒng)通常會產生不溶的無活性的蛋白聚集，即包涵體（Inclusion Bodies,IB），這是該系統(tǒng)應用的巨大障礙。隨著對大腸桿菌中蛋白質折疊機制的深入研究，目前己經找到了一些提高重組蛋白在大腸桿菌中可溶性表達的方法：其中，低溫誘導和融合表達策略是最有效的方法。
　　本文以含有小牛凝乳酶cDNA的pUC18-CYM質粒為模板，通過rKOD DNA聚合酶反應體系對CYM基因

3、進行PCR擴增，上游增加了Hind III酶切位點、下游增加了Xba I酶切位點。擴增產物克隆至pUC57克隆載體，利用兩種不同的可提高可溶性表達的載體，即冷啟動表達載體（pCold）和低溫融合表達載體（pCold-SUMO）構建pCold-CYM與pCold-SUMO-CYM原核表達系統(tǒng)，并選擇先進的突變體菌株（Arctic和 Origami）作為宿主菌對CYM基因進行原核表達。同時，研究了表達溫度、融合標簽、誘導條件等因素對蛋白表達

4、量和表達形式的影響?？扇苄苑治鼋Y果表明，通過低溫誘導可明顯地放慢細胞內蛋白表達速率，減少二硫鍵錯誤折疊幾率；融合標簽的選擇可極大地影響蛋白的表達量和可溶率，并可以在此基礎上通過表達條件的優(yōu)化使蛋白取得良好的可溶效果。此外，正確選擇突變體菌株也可以有效地幫助蛋白減少二硫鍵的錯配幾率，促進其正確折疊從而增加蛋白可溶性。我們通過研究牛凝乳酶蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達方案，對各種影響可溶性幾率的條件進行了分析和優(yōu)化，并根據(jù)本研究結果初步建立了