甲酸脫氫酶基因的克隆表達及重組菌的高密度培養(yǎng).pdf_第1頁
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文檔簡介

1、甲酸脫氫酶屬于D-2-羥基酸脫氫酶類，它可以將甲酸氧化為CO2，同時將NAD+還原為NADH。NAD+依賴型的甲酸脫氫酶(FDH)廣泛存在于自然界中，目前已經在多種細菌和真菌中發(fā)現了FDH，甚至在一些哺乳動物細胞中也發(fā)現了甲酸脫氫酶基因，例如鼠類和人類。 甲酸脫氫酶在工業(yè)生產中有著重要應用，常用于工業(yè)生產中的輔酶再生體系。由于從自然界天然微生物中提取FDH成本比較高，目前對甲酸脫氫酶研究的主要方向集中于采用基因工程方法構建重組菌

2、，通過重組菌的高效表達獲得酶。 本文首先利用YPD培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)了含有NAD+依賴型的甲酸脫氫酶基因的博伊丁假絲酵母，提取基因組，并以此基因組為模板進行PCR擴增，得到大小約為1.1kb的基因片段。將此小片段和T載體pMD18-TSimpleVector連接，得到重組質粒載體pMD18-T-fdh。雙酶切表達載體pET28a(+)和pMD18-T-fdh，經T4DNA連接酶連接得到重組質粒pET28a(+)-fdh。將重組

3、質粒轉化到表達宿主菌EcoliBL21(DE3)中進行表達，經SDS-PAGE電泳驗證蛋白表達。 重組菌構建成功后，對重組菌的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。得到了優(yōu)化培養(yǎng)基：Na2HPO4·7H2O13g/L，NaCl0.5g/L，KH2PO43g/L，NH4Cl3.5g/L，MgSO40.2g/L，葡萄糖10g/L，微量元素2ml/L；培養(yǎng)條件為：搖瓶裝液量30ml/250ml，初始pH值為7.5，接種量為4％；誘導條件為：對數生長前期

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