鼻咽癌細胞放射抗拒的差異蛋白質組學分析.pdf

1、[研究背景及目的]
　　鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國常見的惡性腫瘤之一，以南方地區(qū)尤為高發(fā)，放療被認為是首選的治療手段。然而，臨床上部分病人放療后出現(xiàn)局部殘留與局部復發(fā)，腫瘤細胞的內在放射抗拒性是重要原因之一。目前國內外在基因水平上對腫瘤放射抗拒機制進行了大量的研究，但尚未發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌中表達中能良好預測腫瘤放射抗拒性及其預后的基因或蛋白，據(jù)推測主要原因可能為mRNA的表達豐度與其相應的蛋

2、白質表達水平的不一致性造成的。應用蛋白質組學技術為從蛋白質表達水平進一步探討鼻咽癌放射抗拒機制提供可能性。
　　蛋白質組學技術已普遍應用于基礎及臨床研究的多個領域，它可從整體分析細胞內動態(tài)變化的蛋白質組分，了解蛋白質之間的相互作用網(wǎng)絡，從而揭示蛋白質功能及生命活動規(guī)律。目前，鼻咽癌的蛋白質組學研究主要集中于鼻咽癌的早期診斷和篩選腫瘤標志物等方面。以體外培養(yǎng)的腫瘤細胞為研究對象，可以避免臨床組織樣本引起的組織異質性、影響因素復雜、陽

3、性結果易丟失等諸多缺點。因此，從體外培養(yǎng)的腫瘤細胞系開始逐步過渡到臨床成為當今研究放射抗拒機制的主要方法之一。
　　本研究通過建立和優(yōu)化細胞蛋白質樣品的制備方法，再對具有穩(wěn)定放射抗拒性的鼻咽癌細胞系CNE-2R及其親本細胞系CNE-2進行差異蛋白質組學分析，從而找到與放射抗拒相關的差異表達蛋白。擬在蛋白質表達水平初步闡明鼻咽癌放射抗拒的分子機制，也為今后臨床預測鼻咽癌病人個體放射敏感性并實施個體化放療提供新的思路。
　　[研

4、究方法]
　　1、分別采用三種方法對人鼻咽癌細胞CNE-2進行總蛋白質的提取和雙向電泳分析，建立穩(wěn)定性與重復性俱佳的細胞蛋白質樣品制備方法。
　　2、分別提取處于對數(shù)生長期的具有穩(wěn)定放射抗拒性細胞株CNE-2R及其親本細胞株CNE-2的總蛋白，進行雙向凝膠電泳。
　　3、電泳后經(jīng)硝酸銀染色，應用ImageMaster2-DE Platinum5.0軟件對凝膠進行分析，表達水平相差2倍以上的蛋白質點為差異蛋白點，切取膠上

5、的差異蛋白質點，并行脫色、酶解、萃取，為后續(xù)質譜分析奠定基礎。
　　4、應用基質輔助激光解吸/電離飛行時間串聯(lián)質譜(MALDI-TOF-MS)技術對選取的差異蛋白斑點，進行蛋白質鑒定分析。在Mascot蛋白數(shù)據(jù)庫中檢索，進行蛋白的鑒定，通過人工檢索文獻數(shù)據(jù)庫，深入分析蛋白質的功能。
　　[研究結果]
　　1、采用通用裂解液裂解細胞，等電聚焦前在樣品中加入Destreak試劑，可以獲得穩(wěn)定性好、圖像清晰、分辨率高的雙向電

6、泳圖譜。
　　2、通過雙向凝膠電泳技術，使具有穩(wěn)定放射抗拒性細胞株CNE-2R及其親本細胞株CNE-2的總蛋白得到較好的分離，并篩選出32個差異蛋白質點。
　　3、32個差異蛋白質點中有16個蛋白質點被成功鑒定，通過進一步的生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的蛋白為信號轉導相關蛋白、分子伴侶、細胞骨架成分，在生物學功能方面主要與凋亡調節(jié)、細胞周期調控、RNA轉錄、信號轉導、細胞骨架組成和輻射應激反應等有關。
　　4、其中STM

7、N1在CNE-2R中明顯上調，NPM、hnRNP、AnnexinA3在CNE-2R中明顯下調，NM23僅在CNE-2R中特異表達，表明這5種蛋白質可能參與鼻咽癌輻射抗拒機制的形成，具備深入研究的價值。
　　[研究結論]
　　2-DE結合MALDI-TOF-MS技術能夠有效地識別和鑒定鼻咽癌放療抗拒細胞與其親本細胞系之間差異表達的蛋白質。本研究共發(fā)現(xiàn)16個差異蛋白，提示鼻咽癌放射抗拒機制的發(fā)生是多種蛋白質共同作用的結果。其中S