CaMKδⅡ對心房肌細胞鈣離子流影響的研究.pdf

1、鈣離子是一種細胞內重要的電荷載流子，同時作為一種普遍的介質參與各種細胞過程。在心肌細胞里，這些過程包括基因轉錄、興奮-收縮耦聯及凋亡。眾所周知，細胞內鈣離子傳遞電信號到機械活動，造成單個心肌細胞的短縮進而整個心臟的收縮。然而，近期的研究結果越來越多的證據顯示細胞內鈣超載會導致許多心臟疾病，如心肌病、心功能不全和心律失常。
　　鈣/鈣調素依賴的蛋白激酶Ⅱ(CaMKII)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它可以磷酸化細胞內的許多種蛋白，從

2、而使得細胞內的鈣離子濃度提高。CaMKII在正常的心肌細胞以及病理狀態(tài)下的心肌細胞里的鈣循環(huán)都起著重要的調控作用。而且，近期證實，CaMKII有可能成為一個針對心臟疾病治療的潛在藥物靶標。許多報道證實在心肌肥厚、心力衰竭和心律失常的病例中，CaMKII的活性增加、表達上調。在心臟疾病中，CaMKII蛋白的含量和活性程度會隨著離子通道的高表達而得到激活和提高。CaMKII有四種亞型α、β、γ及δ，其中δ亞型是CaMKII在心臟最主要的表型

3、。
　　心肌細胞的動作電位有一個獨特的以平臺期為特征的延長的除極電位，它的形成主要是鈣離子內流與鉀離子外流動態(tài)平衡的結果。在很多心臟疾病中心肌細胞的電活動的改變是由于鈣信號蛋白的重塑和其它離子通道蛋白的改變而發(fā)生的。CaMKII是一種廣為人知的調控細胞內鈣離子遷移的頻率和幅度的蛋白激酶，能被細胞CaMKII內較高濃度的鈣離子激活，比如當心率加快時，細胞內鈣增加，激活CaMKII，活化后的CaMKII可以磷酸化許多種絲氨酸/蘇氨酸鈣

4、調控蛋白，諸如L型鈣離子通道（LTCC）、軟諾丁受體（RyR2）、基質網鈣離子受體2a抑制蛋白(PLN)。心肌細胞內CaMKII通過調控細胞內鈣離子濃度而改變動作電位的時程，因此，CaMKII被認為可能與增加心律失常的發(fā)生機會有關。但其中的機制還在不斷探求中。
　　心房纖顫（房顫）是一種臨床上最為常見的心律失常，它的發(fā)生伴隨著血栓栓塞事件的增加和住院率的增加等危害，具有較多的致死率和致殘率。心房纖顫發(fā)生的潛在電生理機制是快速的異位

5、觸發(fā)心律和折返機制，而究其發(fā)生主要是由于延長的動作電位時程及決定于心肌細胞減慢的電傳導和/或縮短的心房肌細胞不應期。臨床上，在心房纖顫的患者的心房肌細胞里，發(fā)現存在有異常增高的細胞內鈣蓄積，并且研究證實心肌細胞內鈣超載，在心律失常的發(fā)生中起著關鍵的作用。同時，在房顫患者的心房肌細胞里也發(fā)現有CaMKII的異常高表達。最近，更多的研究者在關注CaMKII與各種心律失常的聯系機制，但更多的試驗正在涉及到確認是否心房纖顫的發(fā)生及維持與CaMK

6、II直接相關。
　　給予培養(yǎng)的原代心房肌細胞以快速的電場刺激，被用來模擬在體外心房纖顫的細胞微環(huán)境，且電場刺激被證實通過縮短動作電位時程致易于發(fā)生房顫使得心房肌發(fā)生電重構。但在這一過程中CaMKII的功能及作用還未被明確。我們設想增加心房肌細胞內CaMKIIδ的表達量會影響到基質網的鈣釋放以及L型鈣通道鈣離子內流，而快速的電場刺激模擬增加的心率致細胞內鈣短暫增加而激活CaMKIIδ，從而改變細胞內鈣離子穩(wěn)態(tài)，致房顫的發(fā)生。

7、　　本研究通過改變CaMKIIδ表達量來探索其在電場刺激導致心肌細胞鈣變化中的作用，可以為房顫的治療提供一定的理論基礎。
　　實驗方法:
　　病毒載體構建和病毒制備：大鼠CaMKIIδ(NM_012519)的cDNA從Open Biosystems購買(7939424)。開放閱讀框通過PCR的方法連接到慢病毒載體LV-IRES-RFP中，得到質粒LV-CaMKIIδ-IRES-RFP. CaMKIIδ通過CMV啟動子驅動表達

8、。為了下調CaMKIIδ表達，我們設計了三對siRNA，并且連入慢病毒載體，此載體中siRNA通過雙向啟動子表達。所有質粒都通過測序驗證。慢病毒顆粒通過將包裝質粒和病毒載體共轉染293FT細胞獲得，粗制的病毒液收集后超速離心可獲得滴度108 TU/ml的病毒液，用于后繼實驗。
　　原代心肌細胞培養(yǎng)和轉染：從新生大鼠（1-2天）上快速分離心臟，再將心室分離并用0.125％胰酶和0.1％膠原酶I消化。收集單細胞懸液，按0.5～1×10

9、4/cm2的密度接種于6孔板或玻片上.48小時后，按MOI=10加入慢病毒。培養(yǎng)48小時后，將培養(yǎng)基換為新鮮DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)細胞待后繼使用。
　　心肌細胞電場刺激：培養(yǎng)的原代心肌細胞置于培養(yǎng)箱內，加上連續(xù)電場刺激24小時。電場由計算機控制，電波頻率10Hz，電壓1.5 V/cm。
　　細胞鈣檢測：咖啡因刺激的鈣流通過掃描共聚焦顯微鏡進行觀察。L型鈣離子通道電流通過膜片鉗檢測。挑選帶有紅色熒光的心肌細胞進行檢測。為了消除細胞

10、大小差異的影響，電流強度定義為電流密度除以細胞電容。
　　結果:
　　成功構建了CaMKIIδ基因的表達慢病毒載體，通過轉染293FT細胞制備慢病毒，可以得到高滴度的病毒液，用此病毒轉染原代心肌細胞，能夠在細胞內獲得較好的基因表達。另一方面設計了三條干擾序列，通過轉染293FT細胞并用Western blot檢測篩選出2＃序列具有較好的干擾效率，將此序列構建到慢病毒載體中獲得了干擾CaMKIIδ的病毒載體。
　　成功從

11、新生大鼠心臟分離培養(yǎng)出原代心肌細胞，并通過免疫組化和免疫熒光鑒定培養(yǎng)的心肌細胞純度可達到90％以上。將制備的慢病毒濃縮到108 TU/ml以上，按MOI=10轉染原代心肌細胞，通過熒光顯微鏡及流式細胞儀檢測感染率可以達到70％。而進一步通過western blot和qPCR檢測過表達及干擾病毒的效果，發(fā)現過表達病毒轉染的細胞CaMKIIδ表達為對照病毒的兩倍，而干擾病毒轉染后，CaMKIIδ表達約為對照病毒的50％。從而成功的在原代細胞

12、中獲得了CaMKIIδ的過表達和干擾。
　　對原代心肌細胞進行電場刺激后檢測CaMKIIδ變化，發(fā)現CaMKIIδ的活性增加，但是表達量未發(fā)生變化。進一步檢測過表達和干擾CaMKIIδ的細胞，其表達量在電場刺激前后均未發(fā)生變化。在未刺激情況下，CaMKIIδ的表達變化會導致內質網鈣釋放和L型鈣流的變化。高表達細胞中，L鈣流增加了約25％；而低表達細胞中，其下降了約28％。在電場刺激情況下，CaMKIIδ表達依然導致了胞內鈣的變化。