脂肪干細胞向骨、軟骨細胞誘導分化及新型椎間盤支架構建的實驗研究.pdf

1、目的:
　　 1.探討兔脂肪干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)向骨、軟骨細胞定向分化的能力，為構建組織工程骨軟骨提供理想的種子細胞;比較軟骨細胞共培養(yǎng)法和誘導液培養(yǎng)法誘導ADSCs向軟骨細胞分化的效果，為構建組織工程骨軟骨提供更加有效的誘導方法。
　　 2.用脫細胞脫鈣骨基質(cell-free deminerized bone matrix，CFDBM)和脫細胞髓核基質構建新型一

2、體化纖維環(huán)-髓核雙相支架，并進行理化檢測，探討其作為組織工程椎間盤支架的可行性;探討不同脫細胞方法對豬尾椎間盤纖維環(huán)組織結構及生物力學特性的影響，為構建組織工程纖維環(huán)提供實驗依據。
　　 方法:
　　 1.分離、培養(yǎng)兔ADSCs，將第3代ADSCs分別用成骨誘導液及軟骨誘導液培養(yǎng)，顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，14天后通過組織學觀察和實時熒光定量PCR檢測其分別向骨、軟骨細胞定向分化的能力。
　　 2.分別用與軟骨細胞

3、共培養(yǎng)法和誘導液培養(yǎng)法誘導ADSCs向軟骨細胞分化并鑒定，顯微鏡觀察ADSCs的形態(tài)變化，14天后行甲苯胺藍染色、Ⅱ型膠原免疫組化，實時熒光定量PCR測定軟骨細胞相關基因的表達情況，比較兩種方法的誘導效果。
　　 3.取豬股骨近端松質骨，塑形成外徑10 mm、內徑5mm、厚3mm的骨環(huán)，經脫脂、脫鈣、脫細胞處理制備成纖維環(huán)相支架部分;取豬尾髓核組織，脫細胞后粉碎離心，制備脫細胞髓核基質，注入纖維環(huán)相支架中央，冷凍干燥，交聯，作為

4、髓核相支架部分。通過大體觀察、HE染色、掃描電鏡觀察纖維環(huán)-髓核雙相支架的結構;測定支架的孔隙率、吸水率、壓縮彈性模量;MTT法檢測支架浸提液對ADSCs增殖的影響;Live/Dead染色觀察細胞在支架上的活性。
　　 4.取新鮮豬尾纖維環(huán)，分別用三種脫細胞方法（分別含有Triton X-100、SDS、胰蛋白酶）對其進行脫細胞處理。大體觀察脫細胞處理后的纖維環(huán)，采用組織學與掃描電鏡觀察脫細胞情況及超微結構的變化;測定脫細胞纖維

5、環(huán)的膠原含量、GAG含量及力學參數。
　　 結果:
　　 1.ADSCs體外培養(yǎng)呈長梭形，增殖迅速，穩(wěn)定性好。經過誘導逐漸變?yōu)槌晒羌败浌菢蛹毎?4天后成骨誘導的ADSCs堿性磷酸酶染色、茜素紅染色和von Kossa染色均為陽性;成軟骨誘導的ADSCs甲苯胺藍染色、Ⅱ型膠原免疫組化陽性，Ⅱ型膠原、蛋白聚糖、SOX9的基因轉錄水平明顯增高。
　　 2.兩種方法培養(yǎng)的ADSCs逐漸變?yōu)檐浌菢蛹毎?，甲苯胺藍、Ⅱ型膠原

6、免疫組化均為陽性，其中誘導液培養(yǎng)法細胞染色更深，且Ⅱ型膠原、蛋白聚糖、SOX9的基因轉錄水平明顯高于軟骨細胞共培養(yǎng)法。
　　 3.大體觀察支架呈乳白色;HE染色顯示無細胞殘留;掃描電鏡可見外層纖維環(huán)相支架孔徑大小均勻一致，孔隙相互貫通，中央脫細胞髓核基質微絲連接成網，交界處結合緊密。纖維環(huán)相支架孔徑為(343.00±88.25)μm，一體化支架孔隙率為82.98％±7.02％、吸水率為621.53％±53.31％，壓縮彈性模量為

7、(89.07±8.73) kPa。經MTT測定支架浸提液對細胞的增殖無影響;Live/Dead染色可見細胞在支架上生長良好。
　　 4.組織學及掃描電鏡可見Triton X-100、SDS、胰蛋白酶三組均無細胞殘留;Triton X-100組纖維環(huán)超微結構未見破壞，胰蛋白酶組輕度破壞，SDS組明顯破壞。三組纖維環(huán)膠原含量與天然纖維環(huán)相比無統(tǒng)計學差異;但GAG含量均低于天然纖維環(huán)(P＜0.05)。Triton X-100、胰蛋白酶

8、兩組的力學性能與天然纖維環(huán)相比無統(tǒng)計學差異，SDS組力學參數均低于天然纖維環(huán)(P＜0.05)。
　　 結論:
　　 1.在特定條件下ADSCs可以向成骨細胞及軟骨細胞定向分化;軟骨細胞共培養(yǎng)法和誘導液培養(yǎng)法均可誘導ADSCs向軟骨細胞定向分化，誘導液培養(yǎng)法誘導效果更好。
　　 2.用CFDBM和脫細胞髓核基質制備的一體化纖維環(huán)-髓核雙相支架具有合適的孔徑和孔隙率，無毒，力學性能與天然椎間盤接近，是構建組織工程椎間